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捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)属毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)线虫,是羊(山羊、绵羊)的主要胃肠道寄生虫之一,常常导致羊特别是羔羊贫血、消瘦、甚至死亡,造成重大经济损失。目前的主要防治方法是使用抗蠕虫药,但由于虫体抗药性的产生和蔓延,使得传统的化学药物防治方法受到了严重挑战,随着公众对公共卫生关注程度的提高以及人们对绿色食品的需求不断扩大,药物残留和药物污染问题已成为限制药物使用和开发的重要因素。因此,通过研究免疫学方法来防止该病已经成为当前的迫切需要。本研究进行了捻转矛线虫肌动蛋白(Actin, ACT) DNA疫苗免疫保护实验；同时克隆了捻转矛线虫醛缩酶(Aldolase, ALD)的全长序列。主要工作如下：1.捻转血矛线虫肌动蛋白DNA疫苗的构建与体内表达情况的检测利用DNA重组技术,构建了pVAXl-ACT DNA疫苗。酶切鉴定正确后,免疫小鼠,1周后取肌肉注射部位、非注射部位组织,用RT-PCR和Western-blot检测DNA疫苗的表达情况。RT-PCR检测结果显示,小鼠注射部位肌肉所扩增出的目的条带大小约为1131bp,非注射部位中未能检测到目的条带,从而说明重组质粒在注射部位可以成功转录；Western blot检测结果发现,在注射部位检测到大小为41kD的目的蛋白的条带,而非注射部位未能检测到目的蛋白的条带；这些结果说明本试验成功构建了pVAX1-ACT DNA疫苗,为下一步的动物保护性试验奠定了基础。2.捻转血矛线虫肌动蛋白DNA疫苗的免疫保护性实验使用DNA疫苗pVAXl-ACT,对9-10月龄山羊做了免疫保护性试验。健康山羊15只,随机分成3组,每组5只。其中一组每次免疫00μgpVAX1-ACT,其他两组为不攻虫对照组和攻虫对照组。在试验山羊的背部皮下多点注射免疫,两个对照组用lml PBS代替DNA疫苗,共免疫两次,间隔2周。pVAX1-ACT免疫组和攻虫对照组山羊于第二次免疫14天后口腔接种5000条捻转血矛线虫第三期感染性幼虫。从攻虫后第22至34天,每隔一天采集粪便,虫卵计数。攻虫后35天,屠宰山羊,剖解皱胃,分离雌雄虫体,分别计数。使用DNA疫苗pVAX1-ACT对山羊做免疫保护性试验的同时,采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,测定了所有试验山羊血清特异性免疫球蛋白IgG滴度、血清以及胃粘膜表面和胃粘膜组织匀浆中特异性IgA浓度。在免疫前、初免后14d、二免后14d、攻虫后14d和杀羊前对以下指标进行检测：利用流式细胞术检测了所有试验山羊外周血中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞的变化；利用全自动电子血细胞分析仪对所有试验山羊的外周血中嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和血红蛋白进行了检测;利用ELISA试剂盒对血清细胞因子(IFN-r、TGF-β、IL-4、IL-22)勺浓度变化进行了检测。结果显示：DNA疫苗pVAXl-ACT免疫山羊后,ELISA检测结果表明血清IgG、IgA在首免后14天达到较高水平,二免后抗体水平进一步升高；杀羊后检测胃粘膜表面(MS)与胃粘膜组织匀浆(MH)的IgA,发现胃粘膜组织匀浆具有较高的滴度。在免疫前、初免后14d、二免后14d、攻虫后14d和杀羊前各项检测结果表明：攻虫前,免疫组山羊CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞水平、B淋巴细胞水平显著高于不攻虫对照组(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。免疫组IL-4水平显著上升(P<0.05),IFN-γ,水平有所下降,但变化不明显。TGF-β、IL-22变化规律性不明显。免疫组山羊的嗜酸性粒细胞浓度显著高于不攻虫对照组,单核细胞水平逐渐上升；各组山羊的血红蛋白浓度没有明显差异。攻虫后,免疫组和攻虫对照组山羊CD4+T淋巴细胞水平、CD8+T淋巴细胞水平、B淋巴细胞水平显著高于不攻虫对照组(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。阳性对照组的IL-4含量急剧上升,在63天达到高峰,免疫组和阳性对照组IL-4浓度显著高于阴性对照组(P<0.05)。免疫组和攻虫对照组山羊嗜酸性粒细胞浓度显著高于不攻虫对照组(P<0.05,P<0.05,)免疫组和不攻虫对照组的血红蛋白水平显著高于攻虫对照组(P<0.05,P<0.05,)。用5000条捻转血矛线虫三期幼虫攻击后,pVAX1-ACT免疫组分别在雌虫、雄虫和成虫总数上比阳性对照组显著减少34.10%(P<0.05),31.98%(P<0.05)和33.11%(P<0.05)；阴性对照组未发现成虫。pVAX1-ACT免疫组虫卵减少率为34.4%(P<0.01),阴性对照组始终未检测到捻转血矛线虫虫卵。说明pVAX1-ACT对抵御山羊捻转血矛线虫的感染具有一定效果。3.捻转血矛线虫醛缩酶特性的研究根据GenBank上登录的捻转血矛线虫醛缩酶(Aldolase)基因EST序列(登录号为CB016007,登录长度为743bp)设计基因特异性引物,分别利用5’RACE和3’RACE获得该基因5’端未知区和3’端未知区,从而拼接得到Aldolase基因的全长cDNA。将该序列递交GenBank (登录号为HQ529288)。分析发现：该基因全长1235bp,含有最大开放阅读框(ORF)为1098bp,5’非翻译区(5’UTR)长27bp,3’非翻译区(3’UTR)长110bp。根据Aldolase基因的全长cDNA设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出1098bp的产物,与推导出的ORF长度一样。BLAST分析后将该片段克隆到pET-32a(+)载体中,转化入感受态大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达融合蛋白。SDS-PAGE结果分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达,分子量约58kDa。以自然感染的山羊血清作为一抗,western blot分析结果显示分别在58kDa处出现特异性条带。酶活性测定结果表明该重组蛋白具有一定的醛缩酶催化活性,其最适反应温度为40℃,pH值为8。