研究背景及目的登革热是最常见的世界范围内通过蚊媒传播的病毒感染性疾病,白纹伊蚊和埃及伊蚊作为登革病毒最重要的传播媒介,能迅速引起病毒的蔓延和传播。在世界范围内100多个亚热带和热带国家中,有25亿左右的人有感染登革病毒的风险,该范围还呈现逐年扩大的趋势。目前,登革热已成为最受关注的由节肢动物传播的病毒性疾病。我国的登革热疫情主要是由输入性病例引起,主要在福建、江苏、浙江、海南、广东等沿海省份流行,但近几年,开始出现向内陆传播的趋势,我国的山东、浙江等省份首次出现历史记载以来的登革热疫情。由于交通便利和人民日益增加的生活需求,全球化城市化,旅游业和商业贸易的发展,特别是我国实施的“一带一路”国家战略等,都使登革热病原体的输入不断增加,气候以及环境的变化更适宜伊蚊滋生,同时病毒进化和变异可能导致传播潜能及其毒性的改变等因素的影响,登革热的流行日益严重,发病人数不断攀升。目前登革热没有特定的治疗方案,临床上多以对症治疗为主,且登革热疫苗的开发研究受病毒的多抗原性和遗传多样性,以及不同血清型间缺乏交叉免疫保护等因素限制,特别是不同血清型间存在病毒感染的抗体诱导效应,即抗体介导的感染增强作用(Antibody Dependent Enhancement,ADE),使登革热疫苗的研究和应用受到严重的困难。因此,研究登革病毒不同血清型间的传播潜能、相互作用及其致病性的差异是非常必要的。目前认为登革热仍然为输入性病例所导致的本地暴发流行,但输入的不同血清型登革病毒表现出了传播差异。本研究拟通过分析近几年来广东省登革热的分子流行病学特征,分析多年来本地区主要流行Ⅰ型和Ⅱ型登革热的流行病学现象,探究Ⅱ型和Ⅲ型登革病毒不同血清型间的流行病学差异和毒株差异,为登革热传播阻断机制及其疾病防控研究提供理论依据。研究方法1.收集2014-2018年广东省登革热流行资料,分析2014-2018年广东省登革热流行的主要亚型及病原谱分子流行病学特征;2.采集2014-2018年深圳市登革热患者急性期血清样本,进行核酸和血清学检测,并对阳性临床样本进行病毒分离;3.扩增成功分离的登革病毒E基因NS1基因的全长序列,进行序列比对和同源性分析,同时绘制系统进化树;4.将含有NS1重组蛋白、登革病毒和小鼠血液的混合物用体外喂养系统饲喂伊蚊,研究NS1对登革病毒体外传播的影响;5.对比不同血清型的登革病毒在Vero细胞和C6/36细胞中的感染差异,并用噬斑实验证实不同血清型的登革病毒复制差异;6.用酶联吸附试验和蛋白印迹实验对比不同血清型的登革病毒在细胞中的分泌NS1的差异。研究结果1.2014年广东4.9万例登革热患者中95%由Ⅰ型登革病毒感染引起;2015年广东1796例登革热患者中88.5%由Ⅱ型登革病毒感染引起;2018年广东2963例登革热患者中59%由Ⅰ型登革病毒感染引起,36%由Ⅰ型登革病毒感染引起。虽然由Ⅲ型、Ⅳ型登革病毒感染引起的登革热病例每年均有输入,但该类输入病例未引起本地病例的暴发流行;2.从流行病学上证实了输入的不同血清型登革病毒在广东省造成二代感染的能力存在显著性差异,Ⅰ型、Ⅱ型的传播能力显著高于Ⅲ型登革病毒;3.从输入性登革热病例血清中成功分离Ⅲ型和Ⅳ型登革病毒,从5位感染了Ⅲ型登革病毒,3位感染了Ⅳ登革病毒的患者血清中成功分离出4份Ⅲ型登革病毒和2份Ⅳ型登革病毒;4;4.BLAST同源性分析及进化树结果显示,与深圳Ⅲ型登革病毒分离株同源性较高的流行毒株是菲律宾及印度尼西亚分离株,与深圳Ⅳ型登革病毒分离株同源性较高的流行毒株是意大利、菲律宾及印度尼西亚分离株;5.NS1氨基酸序列分析结果显示,四种不同血清型的登革病毒氨基酸相似性为77.69%,四种不同血清型的登革病毒NS1存在5-7个氨基酸保守区域;6.伊蚊感染率差异结果显示,NS1重组蛋白对伊蚊感染登革病毒有明显促进作用;7.登革病毒体内复制动力学研究结果表明,DENV-2感染的细胞比被DENV-3感染的细胞更早出现细胞变圆、融合、细胞脱落等病变,且病变更明显,DENV-2在细胞内的复制比DENV-3快;8.酶联吸附试验和蛋白印迹实验结果显示,DENV-2感染的Vero细胞比DENV-3感染的Vero细胞分泌更多的NS1蛋白。结论2014年以来,广东省各亚型登革热均有输入,由输入性病例造成二代感染引起本地流行,但本地流行主要以登革Ⅰ型和登革Ⅱ型为主,Ⅲ型和Ⅳ型输入性登革热病例未导致本地暴发流行,从流行病学上证实了输入的Ⅰ型、Ⅱ型登革病毒在广东省本地造成二代感染的能力显著性高于Ⅲ型登革病毒。本研究结论表明,应该切实对输入性病例早发现、早诊断、早治疗,特别是对临床症状不典型病例的早期诊断和治疗,同时应加强对出入境流动人口的检测和排查,做好爱国卫生运动、蚊媒监测与杀灭。四种不同血清型的登革病毒氨基酸存在高度的相似性,因此不同血清型的NS1蛋白保守区可以作为一个诊断抗原的候选分子,基因变异是血清分型和分支的重要决定因素,并决定不同的病毒性、毒力和流行潜能。本研究证实Ⅱ型登革病毒在细胞中显示出更强的复制能力和致病能力,Ⅱ型登革病毒在蚊体内复制能力略强于的Ⅲ型登革病毒。Ⅱ型登革病毒分泌更高水平的NS1蛋白,蚊媒实验证实同亚型的NS1重组蛋白促进病毒更高效的感染伊蚊,进而导致蚊虫的病毒感染率大幅上升,但登革病毒的流行和致病的严重程度受多种因素影响,Ⅱ型登革病毒和Ⅲ型登革病毒在蚊媒体内的传播潜能差异机制还有待进一步深入的研究。