目的：　　我国是肝癌高发区，全球每年一半以上的新发病例在中国，因缺乏有效的全身治疗药物，使得肝癌的预后极差，目前迫切需要研究开发出更有效的方法来治疗肝癌。miR-135b 是新近发现的一种 microRNA，目前研究发现其与多种恶性肿瘤的发生、发展、预后及化放疗的敏感性等有关。但有关miR-135b在肝癌中的表达情况、作用机制及其是否与肝癌细胞耐药的产生、药物敏感性等有关还知之甚少。因此本研究的目的首先明确 miR-135b 在常见肝癌细胞株中的表达水平。观察肝癌细胞株内稳定过表达miR-135b 后肝癌细胞增殖、迁移、侵袭以及药物敏感性的变化。探索 miR-135b 过表达后引起索拉非尼耐药的主要原因和机制，并探讨应用特异性小分子抑制剂逆转索拉非尼耐药的可能性。　　方法：　　1．实时荧光定量PCR　　选取Bel-7402、HepG2、MHCC97和SMMC-7721等4种不同的肝癌细胞株进行培养，用Trizol提取RNA，逆转录为cDNA。以cDNA为模板，利用RT-PCR技术检测4种肝癌细胞株中miR-135b的相对表达水平。　　2．过表达miR-135b的慢病毒载体的构建及细胞的转染　　应用PCR将前miR-135b的序列从人基因组中扩增出来后，构建到慢病毒载体pLenti-CMV-GFP-puro中，同时以空载体作为阴性对照，酶切后应用 Sanger测序技术确认序列正确以后，转化到大肠杆菌 DH5α 中，大量扩增后进行质粒抽提，去除内毒素，调整质粒浓度为1μg/μl。与包装质粒△8.92和VSVG按照10:10:1质量比，利用商品化脂质体转染到293T细胞中，48和72小时后收集培养基上清，所得大量慢病毒颗粒联合 polybrene以后转染 SMMC-7721细胞，转染 72小时以后应用荧光倒置显微镜观察细胞中miR-135b的转染效率。使用puromycin筛选稳定表达miR-135b的SMMC-7721细胞株。荧光定量PCR检测转染后的肝癌细胞中miR-135b的表达水平，实验组标记为lenti-miR-135b，空载体对照组标记为lenti-Vector。　　3．MTT实验　　将处于对数增长期的待检测细胞加到96孔板中，细胞密度为1×105 cells/ml，每个时间点设置5个复孔，在1、3、5、7天时分别进行MTT测定。选择570nm波长，酶联免疫仪上测定吸光度A值，计算细胞增殖率。　　4．软琼脂克隆形成实验　　取 6 孔板，应用低熔点琼脂糖配置下胶，先铺下胶，待稍微凝固以后，取对数生长期的细胞，按照1万细胞/孔加入6孔板中，然后铺上胶，凝固后加入少许培养基，培养2-3周之后，放置在倒置显微镜下进行克隆计数。　　5．划痕实验　　用 marker 笔在 6 孔板背后均匀得划横线，每孔至少穿过 5 条线。在孔中加入约5×105个细胞。待孔内的细胞完全长满以后，用 10μl 枪头尽量垂直于背后的横线划痕。PBS冲洗3次去除划下的细胞，加入无血清培养基。放入37℃、5%CO2培养箱培养，按0、12、24小时取样拍照，计算划痕宽度，值越低表示细胞迁移能力越强。　　6．侵袭实验　　将lenti-miR-135b和lenti-Vector组细胞加入Transwell小室。加入100μl细胞悬液使得小室内细胞数量为1-10万个细胞 。加入含有10%FBS的DMEM/F12培养液培养24h，结晶紫染色30min。用PBS洗2遍后显微镜下观察。计数镜下染色阳性细胞数，阳性细胞数越多说明侵袭能力越强。　　7．药物敏感性实验　　在 lenti-miR-135b和 lenti-Vector组细胞中分别加入常用的抗肿瘤药物包括紫杉醇、顺铂、奥沙利铂和索拉非尼，孵育48小时后，MTT法计算IC50值，比较两组细胞对不同药物敏感性的差异。　　8．细胞周期及细胞凋亡的检测　　经索拉非尼处理lenti-miR-135b和lenti-Vector组细胞48小时后，冷甲醇固定细胞，应用PI单染细胞后，应用流式细胞仪对细胞内DNA含量进行检测，通过软件计算各时相的百分比。同样的方法处理细胞后，应用 Annexin V/PI染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡率变化情况。　　9．免疫印迹实验　　不同浓度索拉非尼分别作用lenti-miR-135b和lenti-Vector组细胞，RIPA裂解液裂解细胞后，收集两组细胞蛋白，SDS-PAGE电泳以后，免疫印迹法分别检测 MAPK、AKT、STAT3等蛋白及其磷酸化形式的表达情况。　　10．移植瘤模型的建立　　在24只裸鼠右前肢皮下注入处于对数增长期的lenti-miR-135b组细胞，构建肝癌SMMC-7721 移植瘤模型，将肿瘤长到一定大小的裸鼠进行随机分组，按 6 只/组，分为miR-135b模型组、索拉非尼组、索拉非尼＋STAT3抑制剂组和索拉非尼＋STAT3抑制剂+AKT 抑制剂组，按不同分组每日给予索拉非尼和小分子抑制剂的不同组合灌胃，游标卡尺检测肿瘤组织大小，绘制肿瘤生长曲线。在35天时处死裸鼠，剥离皮下的肿瘤组织后，称重，测量肿瘤体积后，立刻用福尔马林固定，石蜡包埋以后进行病理切片，HE和Tunel染色，统计每个视野中TUNEL阳性细胞数目，评估组织凋亡水平。　　11．统计分析　　对实验结果采用 SPSS 11.0 软件进行统计分析，计量数据一般用平均值±SD 表示，使用t检验比较成对数据，使用Anova对多组数据进行分析。P>0.05 提示结果无统计学差异，*P<0.05 提示结果有统计学差异，**P＜0.01提示存在极为显著的统计学差异。　　结果：　　1．肝癌细胞株中miR-135b的表达水平　　miR-135b在4种不同的肝癌细胞株中均有不同程度的表达，其相对表达水平依次为：HepG2（15.8）＞MHCC97（2.5）＞Bel-7402（2.2）＞SMMC-7721（1.2） ，以SMMC-7721的表达水平最低。　　2．miR-135b过表达慢病毒载体的构建及稳转株筛选　　成功构建表达miR-135b的慢病毒载体，并在293T细胞中包装得到病毒，病毒的滴度达到108CFU/ml，转染SMMC-7721细胞72小时后，荧光倒置显微镜下观察GFP荧光情况，其转染率可达到80%以上。随后，对SMMC-7721细胞中的RNA进行提取以后，荧光定量PCR显示在转染miR-135b 的SMMC-7721细胞中，miR-135b的表达量是Vector组的23.1倍。应用2μg/ml嘌呤霉素筛选转染后的细胞，3周左右可以得到稳定表达miR-135b的稳转细胞株。　　3．过表达miR-135b稳转株细胞生物学特性的研究　　在SMMC-7721细胞过表达miR-135b以后，MTT结果提示对细胞的增殖能力没有显著影响。软琼脂克隆形成实验显示，细胞单克隆的数目和大小在 miR-135b 组和Vector 组间都没有显著差异（P＞0.05）。但是，过表达 miR-135b 后可显著增强SMMC-7721细胞的迁移能力，表现为划痕愈合速度在第12小时即出现显著增快（P＜0.05）。Transwell小室研究结果显示，过表达miR-135b后可显著增强细胞的侵袭能力（P＜0.05），统计3个视野中迁移细胞数目显示，在miR-135b过表达组为138±3.5细胞/视野，而在Vector组中为103±7细胞/视野。　　4．药物敏感性实验及机制的研究　　对不同治疗药物的敏感性研究显示，过表达miR-135b以后可以对多种治疗药物产生一定程度的耐药，体现为IC50值的增加，包括紫杉醇（IC50从0.17μM增加为2μM）和奥沙利铂（1.21μM 增加为 4μM） ，尤其以索拉非尼最为显著（15.52μM 增加为45μM，P＜0.05）。细胞周期研究发现，miR-135b过表达细胞株加入索拉非尼48小时以后，G1期细胞比例有一定程度的减少，S期细胞有一定程度的增加，但差异不具有统计学意义（P＞0.05），提示过表达miR-135b以后可能促进细胞由G1期向S期的转换。Annexin V/PI染色结果显示，加入索拉非尼以后在miR-135b过表达组中凋亡细胞的比例较对照组显著减少（P＜0.05），提示过表达 miR-135b 可以抵抗由索拉非尼诱导的细胞凋亡。信号通路分析结果显示，miR-135b过表达细胞中AKT和STAT3途径被活化，体现为随索拉非尼给药浓度的增加，AKT和STAT3磷酸化的蛋白形式的降低趋势被减弱，尤其是对STAT3蛋白磷酸化形式的减弱作用较为明显，而对非磷酸化蛋白的表达水平影响不大。此外对 MAPK以及 MAPK的磷酸化蛋白形式的影响均不明显。索拉非尼联合AKT以及STAT3小分子抑制剂以后可以削弱由miR-135b带来的索拉非尼耐药，表现为细胞凋亡率由 8.8±0.89%（索拉非尼单药组）上调至 55.2±10.0%（3 药联合组）。体内裸鼠肝癌移植瘤模型研究结果进一步证实了体外的研究结果，从肿瘤生长曲线来看，2 药或者 3 药联合组的裸鼠移植瘤增殖速度要显著小于模型组（P＜0.05），其肿瘤体积也显著小于模型组（P＜0.05）。TUNEL 实验显示，3 药联合组有更多比例的细胞出现凋亡，在 3药联合组中，凋亡率可以达到 42%，与单药索拉非尼组和2药联合组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。　　结论：　　miR-135b在不同的肝癌细胞株中均有不同程度的表达，其中在 SMMC-7721细胞中的表达水平最低。过表达miR-135b以后并不影响SMMC-7721细胞的增殖和克隆形成能力，但可显著增强细胞的迁移和侵袭能力。过表达miR-135b后可使SMMC-7721肝癌细胞对多种药物耐受，特别是对索拉非尼最为显著。进一步的研究提示，miR-135b过表达后索拉非尼对SMMC-7721细胞AKT、STAT3途径的抑制效应被显著削弱。体内外实验表明，联合应用对应的小分子抑制剂可以一定程度上逆转由miR-135b引起的索拉非尼耐药。这些研究为临床上miR-135b过表达的肝癌患者开发更加有效的靶向治疗药物奠定了理论基础。