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解偶联蛋白1(uncouplingprotein 1,UCP-1)是生物体解偶联蛋白家族的重要成员,参与机体的产热作用、糖脂代谢、氧化应激、炎症以及相关肿瘤的发生发展。UCP-1作为线粒体代谢的重要蛋白,其表达异常是否影响免疫细胞的功能进而参与相关疾病的进程目前仍不清楚。课题组通过引进UCP-1基因缺陷小鼠(UCP-1./.小鼠),对其免疫功能初步分析,发现相较于野生型小鼠,UCP-1-/-小鼠脾脏、外周血和肝脏中MDSC细胞频率显著增加,且NK细胞在外周的组织分布出现差异并伴随NK细胞功能的降低。因此,UCP-1缺陷对MDSC和NK细胞功能的影响及其分子机制需要进一步明确。本研究拟对UCP-1缺陷影响MDSC和NK细胞的功能及意义展开初步研究,并探究UCP-1在肿瘤和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)中的角色与分子机制。研究内容分为两个部分:第一部分:UCP-1-/-1小鼠MDSC的变化及对移植瘤敏感性分析目的:分析UCP-1-/1小鼠MDSC频率及功能的变化,检测UCP-1-/-小鼠对移植瘤的敏感性,并初步探讨MDSC频率功能变化的分子机制。方法:1.通过流式细胞术分析UCP-1-/-小鼠和同品系野生小鼠在胸腺、骨髓、脾脏、肝脏以及外周血中髓系免疫细胞的频率及亚型差异。2.通过Western blot检测MDSC效应分子iNOS和Arg-1的表达,流式细胞术检测ROS、PD-L1以及IL-10的表达,明确MDSC的效应分子表达的改变;构建移植瘤模型分析UCP-1-/-小鼠对移植瘤的敏感性。3.从增殖分化、细胞死亡以及糖脂代谢角度探索UCP-1对MDSC频率和功能的影响:1)CFSE标记MDSC检测野生鼠和UCP-1-/-小鼠MDSC增殖能力;检测骨髓细胞体外诱导分化MDSC的能力;分析MDSC增殖相关信号分子p-NF-κB与p-c-Myc的表达。2)分析MDSC在体外凋亡特性;检测细胞凋亡信号分子Caspase3、Caspase8 与 Bcl-xl;细胞焦亡信号分子 Caspase1、Caspase11 以及 GSDMD。3)检测UCP-1-/-小鼠血清游离脂肪酸、甘油三酯和胆固醇水平;分析MDSC在UCP-1缺陷前后糖脂代谢中关键分子CD36、Glut1、HK Ⅱ、CPT-1、ACC以及线粒体质量差异。结果:1.生理状态下UCP-1--小鼠脾脏、外周血与肝脏中MDSC频率增加,而在骨髓中没有明显变化。与PMN-MDSC相比较,M-MDSC增加更为显著。2.相较于野生小鼠,UCP-1-/-小鼠MDSC中ROS表达下降,Arg-1、iNOS、PD-L1以及IL-10无变化;肠癌移植瘤在UCP-1-/-小鼠中生长更加迅速,肿瘤体积也更大。3.UCP-1-/-小鼠MDSC增殖能力增强,增殖分子p-NF-κB和p-c-Myc表达增加;抗凋亡蛋白Bcl-xl表达增强,Caspase3与Caspase8表达无差异;焦亡信号分子Caspase1、Caspase1 1以及GSDMD表达无变化;UCP-1-/-小鼠血浆中甘油三酯、游离脂肪酸无变化但胆固醇降低;UCP-1-/-小鼠MDSC线粒体质量降低,糖酵解关键酶Glut1和HK Ⅱ表达增强,脂肪酸合成酶ACC表达降低,脂肪酸氧化磷酸化蛋白分子CD36与CPT-1表达无差异。结论:1.UCP-1-/-小鼠脾脏、外周血与肝脏中MDSC频率增加,且主要为单核样MDSC(M-MDSC)频率增加。2.UCP-1-/-小鼠对肠癌移植瘤敏感性增强并可能与MDSC的频率的增加有关。3.UCP-1-/-小鼠MDSC频率的增加与其增殖能力增加和死亡减少相关。4.UCP-1-/-小鼠MDSC的糖脂代谢发生并可能与其功能的变化相关,相关研究需进一步深入。第二部分:UCP-1-/-小鼠NK细胞变化及对非酒精性脂肪肝敏感性分析目的:分析UCP-1-/-小鼠NK细胞组织分布及功能的变化,观察UCP-1-/-小鼠对非酒精性脂肪肝的敏感性。方法:1.流式细胞术检测野生小鼠与UCP-1-/-小鼠NK细胞和NKT细胞以及NKG2D及IFN-γ的表达在脾脏、肝脏、外周血及胸腺中的频率变化。2.油红染色法检测非酒精性脂肪肝模型中野生小鼠和UCP-1-/-小鼠肝脏脂肪浸润情况;流式细胞术分析在非酒精性脂肪肝模型中小鼠NK细胞组织分布差异,NKG2D与IFN-γ的表达。3.Western blot检测CD3-NK1.1+细胞内代谢分子(mTOR)的表达;流式细胞术检测NK细胞中ROS水平。结果:1.生理状态下,UCP-1-/-小鼠肝脏中NK细胞的频率降低,而脾脏及外周血中NK细胞频率、NKG2D及IFN-y的表达无差异。2.UCP-1-/-小鼠在非酒精性脂肪肝发病中明显加重,肝细胞出现明显的脂肪变性,脂质浸润;UCP-1-/-小鼠中NK细胞及NKG2D在脾脏、外周血与肝脏中都出现明显的降低。3.UCP-1-/-小鼠NK细胞ROS表达降低,mTOR表达降低。结论:1.生理状态下,UCP-1-/-小鼠NK细胞在肝脏的分布减少。在非酒精性脂肪肝病发病中,UCP-1-/-小鼠NK细胞的频率和功能出现降低。2.UCP-1-/-小鼠对非酒精性脂肪肝病的发展表现出更强的敏感性,NK细胞在外周血及肝脏中频率降低,NKG2D以及IFN-γ的表达降低对非酒精性脂肪肝病的的发展是否发挥作用及其机制需要进一步研究。