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背景外周神经损伤是现代生产生活中常见的组织损伤,对于短节段的神经缺损,在临床上可以通过神经断端吻合修复。但是长节段的神经缺损,特别是缺损超过5cm者,自体神经移植仍然是治疗的“金标准”。但受限于自体可移植神经组织供给极为有限,同时供给区的组织功能会受到严重影响,使得临床上外周神经损伤愈后有很高的致残率。近年来,使用组织工程学方法,研制具有高度仿生结构、良好桥接功能的“人工神经”成为研究的热点。对其结构模型、材料、制备工艺、各类种子细胞、生长因子及促神经生长药物、修复后神经功能的恢复等进行了深入研究。前期研制的人工外周神经支架在促进受损神经纤维再生方面取得一些成果,但所修复神经在功能恢复方面尚存不足,神经病理性痛的发生极为常见。目的改良构建工艺参数制备新型组织工程外周神经支架,并在支架中复合不同浓度的FK506,在提高外周神经长节段缺损的修复效果的同时,为减轻修复过程中出现的神经病理性痛提供实验依据,为临床治疗提供新的策略。方法(1)以Ⅰ型胶原蛋白和壳聚糖为主原料,加入不同浓度的FK506,利用梯度冷淋结晶原理,通过改良冰冻干燥工艺制备新型组织工程外周神经支架。(2)运用扫描电镜观察所构建组织工程外周神经支架的内部微观结构。(3)共分4组建立动物模型。实验1组:自体神经对照组;实验2组:复合FK506(5mg/ml)支架修复组;实验3组:复合FK506(10mg/ml)支架修复组;实验4组:空白支架修复组。使用所构建支架桥接SD雄性大鼠坐骨神经10mm缺损。(4)在术后4周、8周、12周、16周,分别测量坐骨神经功能指数。(5)在术后16周,运用双极电极测量SD大鼠坐骨神经复合肌肉动作电位(compoundmuscleactionpotentialsCMAPs)的潜伏期(theCMAPlatencyofonset)、传导速度(nerveconductionvelocityNCV)和波幅(theCMAPspeakamplitude)。(6)在术后16周,取材,甲苯胺蓝染色桥接再生神经纤维,运用透射电镜观察其结构。(7)分别在术前、术后4周、8周、12周、16周,运用Von-Frey系统检测SD大鼠术侧机械性缩足阈值变化。(8)运用Hargreave热辐射系统分别在术前、术后4周、8周、12周、16周,测试SD大鼠术侧热缩足潜伏期变化。(9)在术后16周,运用旷场运动试验来观察分析SD大鼠的运动功能及行为学变化。(10)运用免疫荧光组化检测术后16周DRG神经元细胞膜电压-门控钠离子通道Nav1.7、Nav1.8通道蛋白的表达变化。结果(1)采用新工艺制备的新型组织工程外周神经支架,大体外观为蓝紫色、圆柱状结构,潮湿状态下其弹性模量为3.842±1.326MPa,三维支撑性能良好。扫描电镜显示新型支架横截面微孔内径较为均一,纵截面为轴向平行排列的微管结构,与正常神经基底膜结构高度相似。(2)术后第4周SD大鼠坐骨神经功能指数:1组-79.83±3.43、2组-81.14±3.27、3组-83.21±3.62、4组-86.28±2.64。第8周SD大鼠坐骨神经功能指数:1组-64.29±3.61、2组-65.51±2.97、3组-67.21±3.47、4组-71.03±3.18。第12周SD大鼠坐骨神经功能指数:1组-50.29±4.12、2组-51.03±3.29、3组-56.21±3.58、4组-62.03±4.13。16周SD大鼠坐骨神经功能指数:1组-38.74±2.19、2组-39.07±2.26、3组-42.53±2.71、4组-56.28±2.64。(3)术后第16周各实验组大鼠坐骨神经复合肌肉动作电位的潜伏期、传导速度和波幅结果:1组:潜伏期1.24±0.12,传导速度17.01±1.13,波幅26.12±2.46。2组:潜伏期1.26±0.13,传导速度16.97±1.17,波幅26.04±2.49。3组:潜伏期1.54±0.15,传导速度16.04±1.87,波幅24.25±2.54。4组:潜伏期2.08±0.24,传导速度14.06±1.94,波幅22.91±2.84。(4)术后第16周取材,术中观察发现,桥接支架已经完全降解,再生神经纤维生长良好。使用甲苯胺蓝染色桥接再生神经纤维,运用透射电镜观察桥接再生神经纤维的结构变化结果显示:各组桥接修复神经组织都有不同程度的再生。其中1组和2组再生神经髓鞘数量多,且髓鞘壁较厚,3组再生神经髓鞘数量比1组、2组少,髓鞘壁相对较薄。4组再生神经组织最细再生神经髓鞘数量少,髓鞘壁也较薄。(5)运用Von-Frey系统检测SD大鼠术后机械性缩足阈值变化结果:术前:1组3.20±1.17,2组3.31±1.21,3组3.21±1.18,4组3.12±1.08。术后4周:1组18.31±3.97,2组19.51±4.06,3组20.16±4.81,4组23.4±4.58。术后8周:1组8.62±3.72,2组9.82±3.78,3组11.71±4.16,4组13.2±4.29。术后12周:1组5.67±2.94,2组5.80±2.48,3组6.78±3.84,4组8.13±3.94。术后16周:1组4.71±2.71,2组4.91±2.53,3组6.12±3.07,4组7.26±3.46。在术后第12、16周,实验2组获得与实验1组相似的结果,其恢复效果优于实验3组和实验4组。(6)运用Hargreave热辐射系统术前、术后4周、8周、12周、16周,测试SD大鼠术侧热缩足潜伏期变化结果显示:实验1组,4.83±1.87,17.05±3.94,11.57±3.21,7.71±2.94,6.51±2.24;实验2组,5.02±1.92,18.89±4.07,13.60±4.16,7.99±3.01,6.53±2.47;实验3组,4.96±1.81,20.34±4.21,15.97±3.91,10.04±3.22,7.28±2.89;实验4组,4.74±1.73,23.35±4.14,17.57±3.97,12.74±3.47,9.12±3.04。在术后第12、16周,实验2组获得与实验1组相似的结果,其恢复效果优于实验3组和实验4组。(7)术后第16周旷场运动试验结果分析:实验4组大鼠的总运动距离低于与其他三组,组间有差异显著(P<0.05);中央活动路程实验2组与实验1组比较无显著差异(P>0.05);平均速度实验2组与实验1组比较无显著差异(P>0.05)。(8)在术后16周,截取各组所修复神经组织的背根神经节,运用免疫荧光组化技术检测检测对比SD雄性大鼠术侧坐骨神经DRG细胞膜电压-门控钠离子通道Nav1.7、Nav1.8通道蛋白的表达结果,免疫荧光双重标记显示:实验2组与实验3组蛋白表达较低,实验1组比2组、3组高,实验4组表达最高。结论(1)以Ⅰ型胶原蛋白和壳聚糖为主原料,加入不同浓度的FK506,利用梯度冷淋结晶原理,通过改良冰冻干燥工艺制备的新型组织工程外周神经支架,其微管结构与正常神经基底膜结构高度相似,潮湿状态下具有良好的柔韧性,三维支撑性能良好,术后16周取材时见支架组织降解、吸收良好。本实验中所构建的支架桥接修复效果良好,是比较理想的组织工程外周神经支架。(2)在支架的构建过程中加入浓度为5mg/mlFK506,可以在修复神经组织局部达到类似缓释的效果,即能实现局部免疫抑制和促进桥接神经纤维再生的功能,又避免了全身用药的副作用;浓度过高则可能引起类似全身用药免疫功能受到抑制,出现感染等不良反应,也不能更好的促进桥接神经纤维的再生。(3)含有浓度为5mg/mlFK506的新型组织工程神经支架,在桥接修复外周神经再生的过程中同时能有效减轻所修复神经纤维再生后所出现的神经病理性痛,所桥接修复外周神经的DRG细胞膜上电压-门控钠离子通道Nav1.7、Nav1.8蛋白与对照组相比表达下调,可以减轻所修复神经发生神经病理性痛,为进一步改进和构建新型组织工程神经支架提供了实验依据。