泛素化修饰是一种广泛存在于真核生物体内的蛋白翻译后修饰,它是一个多酶级联反应,涉及到E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶,此过程还需要其它分子,如ATP、Mg²⁺等的参与。泛素化过程与机体的多种生理功能调控相关,如细胞的增殖分化、信号转导、蛋白定位、DNA损伤修复、自噬、生长发育和凋亡等。在人的细胞中有2个泛素激活酶（E1）、40多个泛素结合酶（E2）以及600多个泛素连接酶（E3）。体外泛素化反应在泛素化修饰研究中十分重要。其中一个关键的问题是如何获得大量有活性的E1、E2和E3以满足体外泛素化反应的要求。体外泛素化反应中,通常会用UBA1作为E1来起始泛素化反应,所以只有大量获得有活性的UBA1才能满足体外泛素化实验以及泛素相关样品制备的需求。目前UBA1的纯化方式有2种:第一种是通过富含UBA1的组织进行纯化;第二种是通过在昆虫细胞或大肠杆菌中过表达后进行纯化。两种纯化方式得到的UBA1的量均很少。因此,我们通过蛋白融合表达的方式提高了小鼠UBA1（mUBA1）在大肠杆菌中的表达。同时,在许多泛素化反应中融合表达的mUBA1比没有融合标签的mUBA1具有更好的活性。磷酸腺苷激酶（adk）是从细菌到哺乳动物几乎所有生物中都存在的一种蛋白,它能够催化2 mol ADP生成1 mol ATP和1 mol AMP。我们通过实验发现adk在大肠杆菌中表达量很高,融合adk也可以显著提高融合蛋白的表达量。通过融合adk与mUBA1,融合蛋白adk-mUBA1的表达量要显著高于之前其他文献中所表达的蛋白量,表达量约为mUBA1的10倍。通过对mUBA1表达量的提升,我们得到的纯蛋白量也得到提升。1 L菌液能够获得的mUBA1大约为1-3 mg的纯蛋白,而adk-mUBA1大约能够获得15-20 mg。从获得的纯蛋白量上对比,adk-mUBA1能够提升约8倍的蛋白量。通过优化亲和纯化条件和阴离子交换条件,能够获得纯度为90%以上的adk-mUBA1和mUBA1。Adk-mUBA1和mUBA1的蛋白性质相同,无论是UBA1通过硫酯键结合Ub,还是通过UBA1向UbcH5B转移泛素活性,或者是通过Ube2S直接形成泛素链活性,或是通过UbcH5B向不同类型的E3转移泛素形成泛素链的活性,二者没有明显差异。在某些反应中,adk-mUBA1的活性明显比mUBA1的活性更强。融合了adk后,adk-mUBA1能够同时具有adk的磷酸腺苷激酶活性和mUBA1的泛素激活酶活性,所以它能够通过adk水解ADP,提供ATP给mUBA1用以活化Ub,从而起始泛素化反应。有一些泛素化反应需要在细胞裂解液中进行。而细胞裂解液中含有大量的ATP水解酶,外源供给的ATP在很短的时间内就会被水解为ADP,从而无法供给mUBA1来活化Ub。现在解决的策略有两种:一是去除细胞裂解液中细胞膜成分（S100）。大量的ATP水解酶都存在于细胞膜上,去除细胞膜成分虽然会大大降低裂解液中的ATP水解酶,但同时也会损失很多的膜蛋白,并且效果也并不理想。二是通过ATP再生系统添加肌醇激酶和磷酸肌醇来通过ADP实现ATP再生。该策略通常只在S100中有作用,在全细胞裂解液中的效果并不显著。通过在细胞裂解液中的泛素化反应比较,adk-mUBA1能够合成的泛素链比mUBA1合成多一倍。通过UbcH5B C85S（UbcH5B C/S）直接在细胞裂解液中接受E1活化的Ub,发现adk-mUBA1也能够比mUBA1生成多约一倍的UbcH-O-Ub。Adk-mUBA1能够通过ADP来作为能源活化Ub,所以它比mUBA1更适合长时间的泛素化反应。Adk-mUBA1通过催化合成E2-O-Ub复合物,可以用于大量合成E2-O-Ub复合物相关的实验中。通过串联亲和纯化,我们获得了纯度约为90%的E2-O-Ub以用于实验研究。Adk-mUBA1还可用于如体外合成泛素链等化学化工合成,满足各种实验的需要。