超大的比表面积和多种独特的理化性质使得纳米材料在生物医药、电子器件、能源、航空航天等领域有广泛应用。基于纳米材料的多种产品正加速进入人们的日常生活,截至2019年3月全球已有3036种商品化的纳米材料正式投放到市场中。纳米材料日益广泛的应用大大增加了其接触人类并进入人体的机会。因此,研究纳米材料对基本生命过程的影响,并更加全面和深入的评价其生物安全性是非常必要的。自噬是细胞的自体吞噬,是细胞通过溶酶体途径降解胞浆组分的过程。作为一种高度进化保守的细胞行为,自噬广泛存在于酵母菌到哺乳动物细胞中。在正常条件下,细胞仅维持基本水平的自噬,以此来降解细胞内衰老或受损的细胞器、聚集或错误折叠的蛋白,并维持细胞内环境的稳定。在饥饿、缺氧等应激条件下,自噬水平会上调以降解细胞内组分,从而为细胞提供必需的能量和营养物质。总之,无论是在正常还是在应激条件下,自噬都为维持细胞的健康状态起到至关重要的作用。此外,自噬紊乱与多种疾病的发生发展之间存在密切关系,例如肿瘤、神经退行疾病、Ⅱ型糖尿病、心脏病等都伴随自噬紊乱。随着纳米材料在多个领域的广泛应用及与人类接触机会的大大增加,研究不同类型纳米材料对细胞自噬的影响是评价其生物安全性不可或缺的重要部分,目前相关研究还处在起步阶段,亟需深入研究。二维片状结构和自身独特的理化性质,使二维过渡金属硫化物（two-dimensional transition metal dichalchogenides,2D TMDCs）在多个领域都有潜在的应用价值,例如用于催化、储能、光电器件、载药、载基因、光热治疗、光动态治疗、生物传感等领域。2D TMDCs广泛的应用前景也大大增加了其与人类接触的机会,例如用于生物医药领域的2D TMDCs能经静脉注射直接进入人体血液循环系统,而肺是这类材料的主要聚集靶器官之一。此外,基于2D TMDCs的多种产品在生产、转运、使用以及废弃的过程中,不可避免地会有低浓度的颗粒物剥落下来并进入空气中,通过呼吸暴露直接与人类肺部发生接触。因此,研究2D TMDCs对人类肺部可能造成的影响具有重要意义。厚度作为二维纳米材料的重要理化性质之一,探究其在2D TMDCs与细胞的相互作用中起到何种作用对于全面认识二维纳米材料的生物效应具有重要意义。本文分别选择不同厚度的二硫化钼纳米片（MoS2 nanosheet,MoS2 NS）和二硫化钨纳米片（WS2 nanosheet,WS2 NS）作为2D TMDCs的两种典型代表,选择人支气管上皮细胞系16HBE和人非小细胞肺癌细胞系A549作为肺部细胞模型,分别研究了不同厚度纳米片在细胞定位不同的情况下造成的细胞功能扰动,尤其是对细胞自噬的影响。由于纳米材料的细胞定位在很大程度上决定细胞命运,因此首先探究了不同厚度纳米片的细胞定位情况。通过原子力显微镜（atomic force microscopy,AFM）表征了不同厚度的MoS2 NS和WS2 NS的厚度和尺寸,结果表明两种MoS2 NS和两种WS2 NS分别具有相似的尺寸和不同的厚度。接下来研究了不同厚度MoS2 NS和WS2 NS的细胞定位情况。经FITC-BSA标记的MoS2 NS或WS2 NS与16HBE或A549细胞孵育后,通过激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope,CLSM）定性观察发现,较薄纳米片主要贴附在细胞膜上,而较厚纳米片大部分进入细胞内部。TEM的定性观察以及半定量统计结果也展现了相似的趋势。除了定性观察和半定量统计,对于不同厚度的MoS2 NS还通过电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）定量Mo元素的方法定量分析了两种MoS2 NS的细胞定位情况,定量结果表明超过80%的较薄MoS2 NS贴附在细胞表面,而超过80%的较厚MoS2 NS进入细胞内。总之,MoS2 NS和WS2 NS的细胞定位趋势一致:少层纳米片倾向结合在细胞表面,而多层纳米片更易进入细胞内部。最后借助计算模拟在分子水平研究了厚度如何影响纳米片与细胞间的相互作用过程,结果表明较薄纳米片倾向粘在膜表面或陷入膜中,而较厚的纳米片即使在较高表面张力下最终也能实现内吞。这些发现充分阐明了厚度对纳米片细胞定位的影响,为进一步探究其引发的细胞扰动起到一定的提示作用。研究2D TMDCs造成的细胞功能扰动对其生物安全性评价是很好的完善和补充。对不同厚度MoS2 NS和WS2 NS的研究发现,这两类纳米片在细胞定位完全不同的情况下,均未引起显著的细胞死亡、细胞膜物理损伤、凋亡以及细胞周期阻滞。考虑到细胞自噬作为一种敏感的细胞功能,任何外部条件的变化都会影响自噬水平。而纳米片与细胞间的相互作用会使细胞处于应激状态,从而增加细胞自噬发生的可能,因此进一步对不同厚度MoS2 NS和WS2 NS能否引发细胞自噬进行了评价,结果表明这两类纳米片分别引发了相当水平的细胞自噬。具体表现为,不同厚度的MoS2 NS和WS2 NS在自噬报告细胞系GFP-LC3-U87细胞和16HBE细胞中都促进了自噬体的聚集,且免疫印迹实验表明MoS2 NS和WS2NS均以剂量依赖的方式引发了水平相当的LC3-Ⅱ的积累。由于自噬体的积聚以及LC3-Ⅱ的积累可能由于自噬体形成增多导致,也可能由于自噬体的降解途径被阻断造成,因此为确认自噬的真正发生进一步进行了自噬流实验,结果表明不同厚度MoS2 NS和WS2 NS均通过诱导细胞发生自噬,而非通过阻断自噬体降解过程,引起细胞内自噬体的聚集和LC3-Ⅱ蛋白的积累。为了揭示不同厚度MoS2 NS和WS2 NS在细胞定位完全不同的情况下分别通过怎样的分子机制引发细胞自噬,接下来进行了蛋白和基因层面的研究。由于mTOR作为自噬调控的中心分子在自噬信号通路中起到至关重要的作用,因此从mTOR入手探究自噬分子机制。免疫印迹实验结果显示不同厚度的MoS2 NS和WS2 NS都以剂量依赖的方式抑制了 mTOR的磷酸化,说明这两类2D TMDCs都通过mTOR依赖的方式引发细胞自噬。我们进一步检测了不同厚度MoS2 NS处理后细胞中84种自噬相关基因的表达水平,发现较薄和较厚MoS2 NS分别引起有差异的基因表达水平的变化。为了进一步阐明这些基因在mTOR依赖的自噬中各自起到怎样的贡献作用,同时借助KEGG数据库在mTOR和两种MoS2 NS处理后发生显著变化的基因之间进行了分子信号网络的构建。结果显示,mTOR、IGF-1、APP以及mTOR、APP分别在较薄和较厚MoS2 NS引发的自噬中起到中心调控作用。对细胞表面相关蛋白APP和IGF-1蛋白层面的检测结果表明,较薄MoS2 NS使APP和IGF-1的表达水平下调,而较厚MoS2 NS下调了 APP的表达。综合基因、蛋白层面检测结果以及分子信号网络构建,我们推断较薄MoS2 NS可能与细胞表面蛋白APP以及IGF-1受体发生作用,而较厚MoS2 NS则与APP相互作用,分别影响APP、IGF-1或APP的表达水平,最终两者均以mTOR依赖的方式引发细胞自噬。对不同厚度WS2 NS处理后的细胞也进行了 84种自噬相关基因的表达水平的检测以及分子信号网络的构建。结果显示,较薄WS2NS可能通过与细胞表面CXCR-4和IGF-1受体的结合,抑制CXCR-4和IGF-1的表达从而引起mTOR依赖的自噬;而较厚WS2 NS可能在细胞内吞过程中与细胞表面蛋白APP相互作用导致mTOR去磷酸化并诱导自噬发生。综上所述,我们对2D TMDCs的两类代表MoS2 NS和WS2 NS与细胞间的相互作用进行了系统研究,发现厚度对2D TMDCs的细胞定位及具体自噬信号通路的扰动都有很大影响。我们发现两类二维过渡金属硫化物均能影响细胞自噬,这充分说明二维过渡金属硫化物的生物安全性应该受到高度关注。此外本工作的独特发现可能提出了二维纳米材料造成细胞扰动的普遍方式,即通过与细胞表面的作用引发细胞功能扰动。