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Wilson病(Wilson disease,WD)是一种可治性的遗传性铜代谢障碍变性病,过量的铜主要沉积于肝脏和脑,脑型WD患者常出现不同程度的神经系统损害症状且往往难以逆转,严重损伤了患者的工作学习等能力。铜沉积所致脑组织损伤的机制错综复杂,铜的异常蓄积可增加ROS释放,导致氧化应激,引起神经元损伤,但高铜诱导神经元损伤的其它调控机制尚不明确。研究发现铜沉积可促进IL-1β和IL-12分泌。高铜可诱导GN11和原代神经元发生神经炎性损伤。WD动物模型TX小鼠脑内铜沉积区域存在炎症因子分泌,并伴有神经元的变性坏死。铜是人体必需的金属微量元素,对中枢神经系统(central nervous system,CNS)功能的维持具有必不可少的作用,然而CNS铜稳态失调,高铜可引起神经炎性损伤,加重CNS的病理损伤。CNS炎症反应的发生具有双重作用,在某些特定情况下有利于神经系统损伤的修复,然而脑内慢性炎症的持续存在则会诱发并加重神经元变性坏死。ROS的释放可通过激活Cer通路促进炎症因子释放,从而诱导神经炎性损伤。这些证据表明,高铜诱导神经元损伤可能机制为过量铜增加ROS释放,激活Cer通路,活化P38MAPK、PKC及JNK,一方面上调炎症因子表达水平发挥促神经元凋亡的作用,另一方面直接导致神经元凋亡,加重神经元变性坏死。因此,研究高铜诱导神经元损伤的机制及可能的干预途径,是研究脑型WD患者的重要治疗学问题。本课题单位在原方肝豆汤基础上加具多环节神经保护作用中药组成肝豆汤改良方,前期研究发现肝豆汤改良方对WD具神经保护作用。但研究尚不能阐明肝豆汤改良方对高铜诱导神经元炎性损伤的调控作用。故本研究拟通过观察肝豆汤改良方对高铜诱导神经元炎性损伤的调控作用以进一步阐明本方的神经保护作用。第一部分研究:目的:研究WD患者炎症因子的表达水平。方法:采用基因芯片技术检测99位WD患者(肝型38例;脑型39例;肝脑型22例)和24位健康者血浆炎症因子的表达水平。结果:研究发现肝型患者和正常对照组相比,IL-5、IL-10、IL-13、IL-21、IL-23、TGF-β1、TNF-α、TNF-β表达量显著增加(P<0.01),GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p70、IL-17、IL-22、IL-28A、IL-17F、MIP-3a表达无显著差异(P>0.05)。与正常对照组相比,脑型患者血浆GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-21、IL-23、TGF-β1、TNF-α、TNF-β水平升高(P<0.01),IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-12p70、IL-17、IL-17F、IL-22、IL-28A和MIP-3a表达无差异(P>0.05)。肝脑型患者与正常对照组相比,血浆IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-23、TGF-β1、TNF-α、TNF-β含量显著增加(P<0.01),IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-12p70、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-28A和MIP-3a表达无差异(P>0.05)。结论:WD患者血浆促炎症因子(IL-2、IL-5、IL-21、IL-23、TNF-α、TNF-β)和免疫调节细胞因子(IL-10、IL-13、TGF-β1)表达水平均较正常人显著增加,表明铜的异常蓄积可诱导WD患者炎症因子表达水平的增加,神经系统炎性损伤可能是脑型WD患者的重要致病机制。第二部分研究:目的:研究肝豆汤改良方对TX乳鼠神经元内Cer信号通路相应分子靶点的调控作用。方法:原子吸收分光光度仪监测肝豆汤改良方对细胞内铜、锌、铁含量的作用;流式细胞仪检测经肝豆汤改良方作用前后ROS释放量的改变;RT-q PCR及Western blot法分别观察肝豆汤改良方对细胞内Cer信号通路相关基因及蛋白表达水平的影响。结果:1.原子吸收分光光度仪观察发现:与模型组相比,肝豆汤改良方能显著降低神经元内铜含量(P<0.01),呈一定程度浓度依赖性;15%含肝豆汤改良方兔血清能显著增加细胞内锌含量(P<0.01),经肝豆汤改良方作用后,较模型组比其铁含量显著减少(P<0.01),并在15%~20%浓度范围内随浓度增加而降低。2.模型组ROS荧光强度较正常组显著增加(P<0.01);经肝豆汤改良方作用后,与模型组比其可显著降低ROS释放量(P<0.01),并呈剂量依赖性。3.RT-q PCR检测结果显示:肝豆汤改良方可显著降低TX乳鼠神经元内ASMmRNA、CermRNA、PKCmRNA、JNKmRNA、P38mRNA、Caspase 3mRNA、Caspase 9mRNA及Cyt CmRNA的表达,上调ERK1/2-mRNA及XIAPmRNA的表达。4.经Western Blot法可知肝豆汤改良方可下调TX乳鼠细胞内ASM、Cer、PKC、JNK、P38、Caspase 3、Caspase 9及Cyt C蛋白表达(P<0.01),上调ERK1/2及XIAP蛋白(P<0.01)。结论:肝豆汤改良方可降低TX乳鼠神经元内铜含量,改善铜负荷引起的神经元损伤;肝豆汤改良方能减少TX乳鼠神经元内ROS的释放量,从而减少高铜诱导的神经元损伤;肝豆汤改良方降低了细胞内ASM、Cer、PKC、JNK、P38、Caspase3、Caspase 9及Cyt C蛋白及基因表达,增加了ERK1/2及XIAP蛋白及基因表达,表明肝豆汤改良方可能调控TX乳鼠神经元内Cer通路,减轻铜诱导的神经元损伤,从而达到改善铜损脑络的治疗效果。