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兽疫链球菌是工业上生产透明质酸(Hyaluronic acid,HA)的主要菌株。目前,工业上应用的主要是通过诱变获得的高产菌株,但缺乏遗传稳定性。几株兽疫链球菌全基因组测序的完成,为兽疫链球菌基因功能研究提供了理论基础。但是,目前还没有高效的基因敲除系统的相关报道。本实验以Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ATCC39920为研究对象,首先构建基因无缝敲除系统,并通过透明质酸合成酶基因(hasA)的敲除验证该系统的可行性,其次我们研究了葡萄糖-6-磷酸异构酶基因(hasE)的功能,主要研究结果如下：在温敏型自杀质粒pSET4s上插入sacB(编码蔗糖果聚糖酶)表达元件,以sacB作为反向筛选标记构建基因无缝敲除系统。研究结果显示,sacB基因的表达使S.zooepidemicus在含有5%蔗糖的培养基上不能生长,因此sacB可以作为兽疫链球菌基因敲除的反向筛选标记。利用上述系统对透明质酸合成酶基因(hasA)进行敲除,验证该系统的可行性。结果显示：(1)通过该系统成功获得hasA基因敲除菌株AhasA。(2) hasA基因的敲除对has operon中其他基因不存在极性效应。(3)△hasA菌株不产荚膜,通过基因回补实验发现△hasA菌株又恢复产HA的能力。表明,△hasA菌株的缺陷仅是hasA基因缺失所致,与其他基因无关。同时,本研究所建立的基于sacB基因的兽疫链球菌基因无缝敲除系统可以用于基因功能研究。hasE基因编码葡萄糖-6-磷酸异构酶(HASE,EC5.3.1.9),催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之间的可逆反应。为了研究hasE的基因功能,我们首先利用无缝敲除系统成功敲除hasE基因。表型分析显示,在THY培养基上,AhasE菌株生长缓慢,菌落较小,无明显HA荚膜。分析△hasE菌株在不同碳源上的生长情况显示,△hasE菌株在以果糖为碳源的培养基上的生长情况明显优于其他碳源。表明,△hasE菌株可以利用果糖部分回补菌株的生长缺陷。通过体外酶活分析对HASE的酶学性质进行研究,结果表明,HASE的最适pH为8.0,最适温度为50℃。以果糖-6-磷酸为底物,测得HASE的米氏常数Km和最大反应速度Vmax分别为：0.49mM和2172.5μmol/(mg·min)。体内酶活分析结果表明,兽疫链球菌的HASE粗酶活是大肠杆菌粗酶活的1.52倍。