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白血病是危害人类健康的血液系统肿瘤,全球白血病发病率和死亡率居高不下,据美国数据统计,每年白血病发病率和死亡率均居所有恶性肿瘤前十位。急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是成人发病率最高的一类血液系统恶性肿瘤,其具有较大异质性,其中,Fms样酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3,FLT3)突变为最常见的AML频发突变,其特征为外周血白细胞数高,常规化疗缓解率低,复发率高,无病生存率及总生存率均显著降低,因此其作为独特的亚型与不良预后密切相关。因此,研究FLT3突变的AML形成及发生发展的机制有重要意义。FLT3是Ⅲ型受体型酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK)家族成员之一,表达于造血前体细胞,在正常造血及免疫系统发育中起着重要作用。FLT3内部串联重复(Internal tandem duplication,ITD)突变为最常见的AML频发突变,FLT3-ITD突变约占AML的25-35%。FLT3-ITD突变有利于FLT3二聚体的形成,导致配体非依赖性磷酸化,组成性激活下游Ras/Raf/MEK/ERK、JAK/STAT及PI3K/Akt/m TOR等多条信号转导通路,促进细胞增殖及存活,抑制细胞凋亡。索拉非尼(Sorafenib)作为多激酶抑制剂,可靶向FLT3,通过阻止其自身磷酸化,并作用于Raf等下游信号通路,诱导白血病细胞凋亡。索拉非尼能提高AML缓解率,但对骨髓白血病残留细胞清除率低,导致后续耐药复发,远期效果不佳,提示骨髓微环境介导了FLT3-ITD~+ AML细胞耐药。因此探究微环境介导耐药的机理及其干预措施,对提高其临床疗效具有重要的意义。课题组前期研究证实,骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)在FLT3-ITD~+ AML患者血清中高表达,体外实验证实OPN在MV4-11细胞与人骨髓成骨细胞共培养体系中表达升高,且通过αvβ3受体介导了黏附、迁移以及化疗耐药,但具体机制不清。近年来白血病干细胞(Leukemia stem cell,LSC)学说指出骨髓微环境能屏蔽白血病干细胞免受化疗药物杀伤,在疾病复发中起到重要作用,提示OPN可能通过其受体维持白血病干细胞的存活从而介导微环境耐药。ALDH1可作为结直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多种实体肿瘤的肿瘤干细胞标记物,但在急性髓系白血病包括FLT3-ITD~+ AML中的作用和功能仍不清楚。本课题进一步明确ALDH1在急性髓系白血病中的作用,ALDH1与OPN/αvβ3通路的关系,以及该通路在微环境介导化疗耐药中的作用,并阐述其机制,为特异性干预骨髓微环境相关靶点提供新的理论依据。研究目的:1、明确ALDH1各家族成员在AML中的表达和预后的作用;2、明确整合素αvβ3亚基和ALDH1A1在基因表达水平的关系;3、研究ALDH1A1在AML细胞株的表达及功能;4、探讨OPN/αvβ3对FLT3-ITD~+ AML化疗敏感性的影响;5、探讨OPN/αvβ3通路活化并维持β-catenin的作用及机制;6、探讨β-catenin/ALDH1A1对FLT3-ITD~+ AML化疗敏感性的影响。研究方法:1、分析TCGA肿瘤数据库,明确ALDH1各家族成员ALDH1A1、ALDH1A2、ALDH1A3、ALDH1B1、ALDH1L1、ALDH1L2在AML中的表达和预后特点。2、分析TCGA肿瘤数据库,明确整合素αvβ3的αv亚基(对应基因为ITGAV)、β3亚基(对应基因为ITGB3)与ALDH1A1的表达相关性。3、通过构建并包装ALDH1A1 sh RNA慢病毒探讨ALDH1A1在AML细胞中的功能。4、通过构建体外人骨髓基质细胞与MV4-11细胞(FLT3-ITD突变)共培养模型,并使用αvβ3阻断性抗体探讨OPN/αvβ3对FLT3-ITD~+ AML索拉菲尼化疗敏感性的影响。5、使用αvβ3阻断性抗体及PI3K抑制剂LY294002,通过蛋白印迹法检测OPN/αvβ3/PI3K/AKT通路及β-catenin活化情况。6、通过构建并包装β-catenin基因CTNNB1 sh RNA慢病毒探讨β-catenin在AML细胞中的功能及索拉菲尼化疗敏感性。研究结果:1、ALDH1各家族成员在AML中的表达和预后的作用:(1)ALDH1A1表达水平和NCCN危险度分层密切相关;(2)ALDH1A1表达水平和患者生存时间呈负相关。2、整合素αvβ3亚基和ALDH1A1基因表达水平的关系:(1)整合素αv亚基基因ITGAV与ALDH1A1基因表达无相关性;(2)整合素β3亚基基因ITGB3与ALDH1A1基因表达呈正相关。3、研究ALDH1A1在AML细胞株的表达及功能:(1)ALDH1A1在FLT3-ITD阳性细胞株MV4-11中表达较高;(2)成功构建ALDH1A1 sh RNA慢病毒载体并成功包装慢病毒;(3)ALDH1A1 sh RNA慢病毒感染MV4-11细胞后能有效敲低目的基因表达;(4)在MV4-11细胞株中干扰ALDH1A1能抑制细胞增殖,影响细胞集落形成能力。4、OPN/αvβ3对FLT3-ITD~+ AML化疗敏感性的影响:(1)MV4-11细胞与人骨髓基质细胞共培养后,其化疗敏感性降低,αvβ3阻断性抗体能部分逆转该效应;(2)αvβ3阻断性抗体能协同索拉菲尼减低MV4-11细胞Bcl-2表达以及增加Bax表达,进而促进细胞凋亡;(3)交联骨桥蛋白后,MV4-11细胞化疗敏感性降低,该效应能被αvβ3阻断性抗体能部分逆转。5、OPN/αvβ3通路活化并维持β-catenin通路的作用及机制:(1)骨桥蛋白增强MV4-11细胞β-catenin的表达及核转位;(2)骨桥蛋白增强MV4-11细胞β-catenin下游基因CCND1及c-Myc的表达;(3)骨桥蛋白通过αvβ3/PI3K/Akt/GSK3β通路增强β-catenin表达,αvβ3阻断性抗体及PI3K抑制剂LY294002能部分阻断β-catenin的表达;(4)人骨髓基质细胞能通过活化PI3K/Akt/GSK3β通路增强β-catenin的表达,αvβ3阻断性抗体能部分阻断共培养后β-catenin的表达。6、β-catenin/ALDH1A1对FLT3-ITD~+ AML化疗敏感性的影响:(1)成功构建CTNNB1 sh RNA慢病毒载体并成功包装慢病毒;(2)CTNNB1 sh RNA慢病毒感染MV4-11细胞后能有效敲低目的基因的表达;(3)干扰CTNNB1降低了索拉菲尼的IC-50值;(4)干扰CTNNB1增加了索拉菲尼诱导的细胞凋亡;(5)敲低CTNNB1后影响ALDH1A1基因的表达。结论:1、ALDH1A1的表达与临床病例参数相关,ALDH1A1高表达提示预后不良,对FLT3-ITD~+ AML患者也可进一步分层;2、敲减ALDH1A1能抑制MV4-11细胞增殖,影响细胞的集落形成能力;3、整合素β3亚基基因ITGB3与ALDH1A1基因表达呈正相关;4、骨髓基质细胞通过OPN/αvβ3活化PI3K/Akt/GSK3β通路,继而活化β-catenin,降低对索拉菲尼的化疗敏感性;5、敲减β-catenin能抑制FLT3-ITD~+ AML细胞增殖,增强索拉菲尼药物敏感性,并能抑制ALDH1A1基因表达;6、整合素αvβ3/β-catenin/ALDH1A1通路可能成为治疗FLT3-ITD~+ AML的新靶点。