目的:六味生物制剂是中药经典名方六味地黄汤经类球红细菌代谢发酵所得。类球红细菌在六味地黄汤代谢发酵过程中,菌体内本身的物质发生了改变,药物也发生了一些基础物质的改变,使得六味地黄汤生物制剂在抗氧化方面作用较之传统原方有显著差异。本课题组在前期已经做了许多有关于代谢后药物发生的物质基础及药理作用的变化的相关研究,但缺乏对菌体的相关研究。为了探讨六味生物制剂抗氧化作用机制,拟通过现代分析方法,分析研究菌体中抗氧化成分发生的变化。以期为六味生物制剂的后续研究提供基础。方法:①类球红细菌的活化及传代:根据常用的菌种活化及传代技术,建立适合本实验的培养方法。②类球红细菌的保藏方法研究:结合常用的菌种保藏方法,建立适合本实验实际情况的菌种保藏方法。③抗氧化成分分析方法的建立:结合紫外-可见光分光光度法、高效液相色谱法等仪器分析技术通过方法学考察建立分析方法。④抗氧化成分提取工艺研究:通过响应面法、正交试验优化提取工艺;⑤抗氧化成分的变化研究采用以上确定的分析方法与提取工艺,对菌体生长过程以及代谢过程中抗氧化成分的变化进行动态跟踪研究,以确定最佳工艺条件。⑥六味生物制剂片剂菌体中抗氧化成分的含量测定通过高效液相色谱法测定六味生物片中相关抗氧化成分的含量。结果:①建立了本实验类球红细菌培养方法,为后期的研究奠定基础;②菌种的保藏方法为:以15%的甘油作为保护剂保藏于-20℃或-40℃冰箱中,或以10%脱脂牛奶作保护剂进行冷冻干燥保藏。③类球红细菌中番茄红素和辅酶Q10的测定方法分别为紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法。其中高效液相色谱条件为:色谱柱:DIKMA Platisil ODS C18柱(250mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇:无水乙醇=20:80,柱温35℃,进样体积10μL,流速1 m L/min。④优化得到最佳提取工艺:番茄红素的最佳提取工艺为:用丙酮作为提取溶媒,皂化时间28 min、料液比1:86(g/m L)、超声时间11 min、提取次数2次;辅酶Q10的最佳提取工艺为:丙酮作为提取剂,1:50(g/m L)的料液比,超声功率为200 W,超声时间为15 min,提取2次。⑤研究了菌体中番茄红素和辅酶Q10在菌体生长及代谢过程中的变化,结果显示,菌体在不同的生长环境下,其中番茄红素和辅酶Q10的含量也会发生相应的改变。⑥经过测定,六味生物制剂片中,番茄红素和辅酶Q10的含量分别为:194.27±33.73μg/g、21.21±0.98μg/g。结论:结合需要建立的菌种活化与扩大以及保藏方法,切实可靠。为生长和代谢过程中类球红细菌中番茄红素和辅酶Q10建立的分析测定方法与提取工艺,简单易行,准确可靠。通过建立的方法研究了菌体中番茄红素和辅酶Q10在不同生长条件下的变化,一方面为六味生物制剂的进一步研究奠定了基础,另一方面,为使用菌体发酵生产番茄红素和辅酶Q10的发酵工艺亦提供了重要参考依据。六味生物制剂中番茄红素与辅酶Q10含量的测定结果,说明六味生物制剂在抗氧化活性的增加与菌体中抗氧化成分的保留有一定关系。