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目的:本实验采用刚地弓形虫速殖子急性感染BALB/c雄性小鼠,研究弓形虫的雄性生殖毒性:①采用腹腔注射刚地弓形虫速殖子的方法,建立弓形虫急性感染致雄性生殖毒性的小鼠模型:监测弓形虫感染后雄鼠的一般状况、睾丸重量、附睾重量、精子数量及形态的变化,并观察小鼠睾丸的病理损伤,确定弓形虫急性感染致小鼠生殖功能损伤的特点。②探讨弓形虫感染后小鼠睾丸生精细胞的损伤以及凋亡相关蛋白在睾丸细胞的表达,分析弓形虫感染对睾丸内不同倍体的生精细胞的损伤是否具有选择性;③检测弓形虫感染后小鼠血清睾酮(T)、促黄体生成素(LH)、睾丸组织内T水平的变化,以及生精小管内激素受体(LHR、AR)的变化,初步探讨弓形虫急性感染对生殖激素的水平及其作用通路的影响。通过以上实验,探讨弓形虫急性感染致雄性生殖障碍的机制,为弓形虫致雄性不育制定防治策略提供理论依据。方法:(1)监测弓形虫感染后雄鼠的体重、睾丸重量、附睾重量、精子数量和形态的变化,并观察睾丸的病理损伤。将BALB/c雄鼠随机分为6组,每组8只。正常A组:正常对照组(0.2mlPBS);感染B组:弓形虫感染组(B1组腹腔注射经胰酶消化后的弓形虫速殖子2.5×10~3个/只,B2组注射5×10~3个/只,B3组注射1×10~4个/只、B4组注射2×10~4个/只);阳性C组:环磷酰胺阳性对照组(40 mg/kg)。攻虫后第6天,称小鼠重量,颈椎脱臼法处死小鼠,摘取睾丸、附睾称重,并制备附睾精子悬液,推片、1%伊红染色,显微镜下计精子数及观察精子畸形;睾丸梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片(5μm),HE染色,观察睾丸的损伤情况和计睾丸生精小管内精子数。(2)探讨弓形虫感染后雄鼠生精细胞的损伤情况。将BALB/c雄鼠随机分为6组,每组10只。正常A组:正常对照组(0.2ml PBS):感染B组:弓形虫感染B组(B1组腹腔注射经胰酶消化后的弓形虫速殖子2.5×10~3个/只,B2组注射5×10~3个/只,B3组注射1×10~4个/只、B4组注射2×10~4个/只);阳性C组:环磷酰胺阳性对照组(40 mg/kg)。攻虫后第6天,摘取小鼠睾丸,去除表面组织及血迹,一侧睾丸制备睾丸单细胞悬液,70%冰乙醇固定,次日PI染色、流式细胞仪检测;另一侧睾丸梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片(5μm),HE染色、病理观察以及SP法检测睾丸内Bax和Bcl-2蛋白的表达。(3)放射免疫法检测弓形虫感染后雄鼠血清T、LH及睾丸组织内T的水平,免疫组化sABC法检测激素受体(LHR、AR)的变化:实验鼠分组同前。攻虫后第6天,颈椎脱臼法处死小鼠,摘眼球采血,取血清,-20℃保存,用于测定小鼠血清T、LH:睾丸制备匀浆后,4℃、8000转/min、离心15min,取上清,-20℃保存,用于测定睾丸组织内T的水平:睾丸组织梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片(5μm),sABC法测定睾丸内激素受体(LHR、AR)的变化。结果:(1)相对于正常A组,弓形虫感染组(B1-4)和阳性C组小鼠的体重略减轻,但经统计学分析无显著性差异(P＞0.05)。B1-4组及阳性C组小鼠的睾丸脏器系数与正常A组相比明显减小(P＜0.05),但附睾脏器系数无显著变化(P＞0.05)。B1-4组和阳性C组小鼠的生精小管内精子数量减少,与正常A组相比差异显著(P＜0.05);附睾精子计数和畸形率与正常A组相比均无显著性差异(P＞0.05)。B1-4组小鼠的睾丸病理切片可见生精小管细胞层次混乱、细胞间隙增大、细胞核凝聚;管腔内有细胞碎片,精子减少甚至缺失,呈生精减少或停滞。(2)流式细胞仪检测发现弓形虫感染组(B1-4)和阳性C组小鼠的睾丸细胞均存在明显的细胞凋亡。其中以二倍体细胞凋亡尤为明显,四倍体细胞数量亦显著减少,与正常A相比差异显著(P＜0.01),单倍体相对变化较小:免疫组化检测:Bcl-2蛋白在B1-4组小鼠睾丸的间质和生精小管内的表达变化与正常A组相比无显著性差异(P＞0.05)。Bax在B1-4组小鼠的生精小管表达明显增强(P＜0.01),主要集中在精母细胞层,在精原细胞、精子细胞、睾丸间质Bax蛋白的变化不明显。(3)弓形虫感染组(B1-4)小鼠的血清LH水平与正常A组相比略有降低,经统计学分析无显著性差异(P＞0.05),其中B1组小鼠的血清LH水平最低,随着攻虫剂量增加,LH水平有轻微上升趋势;阳性C组小鼠的LH水平与正常A组相比略有升高,亦无统计学意义(P＞0.05);B1-4组和阳性C组小鼠的血清T水平均有明显降低,睾丸组织内T水平的降低更为明显,与正常A组相比差异显著(P＜0.01):LH受体表达在各组间(A,B1-4,C)无显著性差异(P＞0.05),而AR在精母细胞层表达明显增强(P＜0.05)。结论:1.弓形虫急性感染小鼠模型适用于探讨弓形虫对睾丸生精细胞及体细胞的损伤机制,不适用于弓形虫对成熟精子形态及其功能影响的研究。2.弓形虫急性感染致生殖障碍的原因可能是损伤了生精器官-睾丸,致使精子生成障碍、出现少精、无精,最终导致雄性的生育力下降。3.弓形虫急性感染引起的睾丸损伤以生精细胞凋亡为主:凋亡对单倍体细胞(精子细胞)的影响较小;对二倍体细胞(次级精母细胞)影响明显,同时可导致四倍体细胞(初级精母细胞)数量减少。Bax蛋白在精母细胞内表达增高明显,但生精细胞、间质细胞、支持细胞内Bcl-2蛋白的表达无明显改变,说明生精细胞凋亡可能与Bax蛋白的表达增强有关。4.弓形虫急性感染可致雄鼠血清睾酮(T)、睾丸组织内T水平降低,并影响到LH的负反馈作用和间质细胞T的合成。5.弓形虫急性感染可致生精过程阻滞于精母细胞,并且AR在精母细胞内表达增高,以代偿T水平的降低;弓形虫急性感染对间质细胞LHR的得表达无明显影响。