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白花丹,主要分布于西南省份,是一个传统的中草药,在广西民间用于散疮、消肿、通经活络,并可以治蛇伤、风湿、乳腺炎以及慢性气管炎等症。白花丹素(Plumbagin)是白花丹的主要活性物质,具有多种生物效应,如抗炎、抗血管生成、抗肿瘤和抗氧化等功效。目前,关于白花丹素在对毒性药物刀豆蛋白A(Concanavalin-A,ConA)体内诱导的急性肝损伤治疗方面鲜有报道。本论文从体内实验探究了白花丹素对ConA诱导的急性肝损伤的保护作用。
我们根据ConA诱导急性肝损伤模型来研究了白花丹素对其肝脏病变的影响。急性肝损伤模型是由单次尾静脉注射20μg·g-1(小鼠体重)的ConA诱导。2μg·g-1(小鼠体重)白花丹素在ConA注射48h前开始腹腔注射给药,每24h给药一次,总共3次;与此同时,对照组小鼠腹腔注射PBS(白花丹素溶剂载体)。在最后一次给药过1h后,尾静脉注射ConA。实验小鼠在ConA注射8h后,经麻醉,采集血清,然后处死,分离肝脏。实验小鼠血清样本送由天津河西区妇幼保健中心临床实验室对丙氨酸转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)肝功能指标做了检测;收集实验小鼠肝脏组织切片使用苏木精-伊红(H&E)染色,利用组织学的方法检测肝脏组织的病变程度,同时进行临床病理评分统计分析;使用ELISA试剂盒检测了小鼠血清中细胞因子白介素-1β(IL-1β)的含量变化;分离肝脏,并剪碎,研磨,使用Percoll分离液分离出单个细胞,通过对一系列细胞表面标记物进行标记:CD45、CD11b、F4/80、CD3、CD4、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10,使用流式细胞术检测肝脏巨噬细胞(CD11b+F4/80+)和T淋巴细胞(CD3+CD4+T)及其各自分泌细胞因子的变化情况。所有测得的数据全都输入Excel表格中进行统计,数据结果的统计分析使用的是GraphPadPrism5软件(USA),细胞流式分析使用的是用FlowJo7.6软件(USA),T检验用于评估组间差异的显著性。图片的处理使用的是AdobePhotoshop12.0×32版(Adobe Systems)。
经过研究我们得出的结果是:(1)肝损伤方面。从刚分离的肝脏外观可以观察到:ConA组小鼠肝脏有明显的淤血沉积现象,而在Plumbagin+ConA组小鼠肝脏的淤血明显减轻;肝功能的血清分析进一步表明:与ConA组相比,Plumbagin+ConA组小鼠血清转氨酶ALT、AST的水平显著降低,提示肝功能得到了改善。
(2)肝组织病理分析。通过H&E染色可以观察到:与ConA组相比,Plumbagin+ConA组的小鼠肝组织中炎性细胞浸润情况明显降低;基于H&E染色的临床病理评分结果表明:与ConA组相比,Plumbagin+ConA组的小鼠肝组织炎症指数显著下降;ELISA结果显示,与ConA组相比,Plumbagin+ConA组的小鼠血清中炎性细胞因子IL-1β的水平显著下降。
(3)肝内免疫微环境分析。肝脏单个活细胞通过Percoll分离液分离以后,经过流式细胞术检测,并使用FlowJo软件分析可以得出:与ConA组相比,Plumbagin+ConA组经过白花丹素的处理,可以通过抑制肝脏组织内巨噬细胞的招募,降低巨噬细胞分泌的促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达水平;并且白花丹素还促进了CD4+T淋巴细胞分泌的抑炎细胞因子IL-4和IL-10的表达水平,共同作用来调节肝脏组织内免疫微环境的状况,从而改善肝脏损伤。
以上结果显示白花丹素对ConA引起的急性肝损伤具有一定保护效果。对ConA诱导的急性肝损伤,白花丹素处理能够改善肝功能,降低炎症,其可能的机制在于抑制巨噬细胞的活化及其分泌的促炎细胞因子表达和促进CD4+T淋巴细胞分泌的抑炎细胞因子的表达。
我们根据ConA诱导急性肝损伤模型来研究了白花丹素对其肝脏病变的影响。急性肝损伤模型是由单次尾静脉注射20μg·g-1(小鼠体重)的ConA诱导。2μg·g-1(小鼠体重)白花丹素在ConA注射48h前开始腹腔注射给药,每24h给药一次,总共3次;与此同时,对照组小鼠腹腔注射PBS(白花丹素溶剂载体)。在最后一次给药过1h后,尾静脉注射ConA。实验小鼠在ConA注射8h后,经麻醉,采集血清,然后处死,分离肝脏。实验小鼠血清样本送由天津河西区妇幼保健中心临床实验室对丙氨酸转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)肝功能指标做了检测;收集实验小鼠肝脏组织切片使用苏木精-伊红(H&E)染色,利用组织学的方法检测肝脏组织的病变程度,同时进行临床病理评分统计分析;使用ELISA试剂盒检测了小鼠血清中细胞因子白介素-1β(IL-1β)的含量变化;分离肝脏,并剪碎,研磨,使用Percoll分离液分离出单个细胞,通过对一系列细胞表面标记物进行标记:CD45、CD11b、F4/80、CD3、CD4、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10,使用流式细胞术检测肝脏巨噬细胞(CD11b+F4/80+)和T淋巴细胞(CD3+CD4+T)及其各自分泌细胞因子的变化情况。所有测得的数据全都输入Excel表格中进行统计,数据结果的统计分析使用的是GraphPadPrism5软件(USA),细胞流式分析使用的是用FlowJo7.6软件(USA),T检验用于评估组间差异的显著性。图片的处理使用的是AdobePhotoshop12.0×32版(Adobe Systems)。
经过研究我们得出的结果是:(1)肝损伤方面。从刚分离的肝脏外观可以观察到:ConA组小鼠肝脏有明显的淤血沉积现象,而在Plumbagin+ConA组小鼠肝脏的淤血明显减轻;肝功能的血清分析进一步表明:与ConA组相比,Plumbagin+ConA组小鼠血清转氨酶ALT、AST的水平显著降低,提示肝功能得到了改善。
(2)肝组织病理分析。通过H&E染色可以观察到:与ConA组相比,Plumbagin+ConA组的小鼠肝组织中炎性细胞浸润情况明显降低;基于H&E染色的临床病理评分结果表明:与ConA组相比,Plumbagin+ConA组的小鼠肝组织炎症指数显著下降;ELISA结果显示,与ConA组相比,Plumbagin+ConA组的小鼠血清中炎性细胞因子IL-1β的水平显著下降。
(3)肝内免疫微环境分析。肝脏单个活细胞通过Percoll分离液分离以后,经过流式细胞术检测,并使用FlowJo软件分析可以得出:与ConA组相比,Plumbagin+ConA组经过白花丹素的处理,可以通过抑制肝脏组织内巨噬细胞的招募,降低巨噬细胞分泌的促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达水平;并且白花丹素还促进了CD4+T淋巴细胞分泌的抑炎细胞因子IL-4和IL-10的表达水平,共同作用来调节肝脏组织内免疫微环境的状况,从而改善肝脏损伤。
以上结果显示白花丹素对ConA引起的急性肝损伤具有一定保护效果。对ConA诱导的急性肝损伤,白花丹素处理能够改善肝功能,降低炎症,其可能的机制在于抑制巨噬细胞的活化及其分泌的促炎细胞因子表达和促进CD4+T淋巴细胞分泌的抑炎细胞因子的表达。