目的和意义：端粒-端粒酶与细胞增殖、分化及衰老等增龄相关性疾病密切相关。端粒封闭染色体末端并维持染色体的稳定性，它随细胞分裂增殖而成比例的丢失，从而导致细胞衰老及死亡；端粒酶的活化，可以以其自身RNA组分(Human telomerase RNA, hTR)为模板，通过端粒酶催化亚单位(Human telomerase reverse transcriptase, hTERT)催化合成并延长端粒，补偿端粒的丢失，维持基因组的稳定，从而满足机体补充、修复及更新的需要。端粒酶的活性决定端粒的长度进而控制细胞的命运，其活性异常可以使细胞凋亡失控、失衡或永生化，进而可导致一系列增龄性疾病，如动脉硬化性心脑血管疾病、2型糖尿病、原发性骨质疏松症和肿瘤等。因此，端粒酶活性调控已成为目前的研究热点：诱导端粒酶活性，可以延长正常细胞增殖和寿命，抑制端粒酶活性，可以导致异常细胞凋亡和衰老。进一步深入了解端粒酶活性调控机制可以为增龄相关性疾病的发病机理和防治机制以及制备治疗性生物工程细胞和干细胞等研究提供新的思路和线索。端粒酶的活性调控是涉及多因子参与多水平调节的复杂过程，hTERT是端粒酶活性的必需组分和关键限速成分，其调控涉及hTERT基因的转录，hTERTmRNA的适当剪接，hTERT蛋白质翻译后修饰，细胞内转运以及将全长的hTERT蛋白组装为全酶等，这一系列细胞内生物事件的正常发挥依赖于hTERT和其结合蛋白的相互作用，对hTERT相互作用蛋白的挖掘研究，有助于更深入探索端粒酶的结构功能以及活性调控作用机制。蛋白质组学技术和生物质谱技术的迅速发展及其有效结合，为研究蛋白质相互作用提供了强大手段，其准确性高与速度快的优点使免疫共沉淀联合质谱分析技术已被广泛应用于寻找生理条件下新的相互作用。本课题研究将免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)与串联芯片液相质谱(High Pressure LiquidChromatography, Chip Hermeticity In Plastics, Mass Spectrum, HPLC-CHIP-MS-MS)有效结合，鉴定出新的hTERT相互作用蛋白原钙粘附蛋白10(Protocadherin10, PCDH10)，并对两者的相互作用所介导的端粒酶活性和肿瘤细胞生物学特性等生物学效应进行初步研究。主要研究内容和结果：1.免疫共沉淀联合质谱技术筛选hTERT相互作用蛋白1.1hTERT免疫共沉淀复合物的获取、分离和质谱鉴定首先获取经行“双侧睾丸切除术”的前列腺癌患者的新鲜睾丸组织，病理证实为正常睾丸组织；Lysis/Wash Buffer裂解获得睾丸组织总蛋白；采用Co-IP Kit利用抗人hTERT单抗免疫共沉淀睾丸组织总蛋白(以IgG为对照抗体)，获得hTERT免疫共沉淀复合物；经Western Blotting证实免疫共沉淀复合物中hTERT的存在，而对照组中没有，同时经SDS-PAGE凝胶电泳分离hTERT免疫共沉淀复合物，考马斯亮蓝染色显示与对照组IgG相比，有hTERT蛋白条带(约120KD)及目的特异性条带存在，证明此法可行；切取2条差异条带经胶内酶解后，通过HPLC-CHIP-MS-MS在高可信度Valid模式下鉴定为PCDH10和SP1。SP1为已报道的hTERT激活的关键转录因子，因此我们选择新的hTERT相互作用蛋白PCDH10进行下一步研究。1.2hTERT和PCDH10相互作用的免疫共沉淀体内验证分别选用抗人hTERT单抗(或抗人PCHD10单抗)进行Co-IP(以不加抗体为对照)，然后以抗人PCHD10单抗(或抗人hTERT单抗)进行Western Blotting检测，结果显示以hTERT单抗免疫共沉淀复合物中有PCDH10的存在，而以PCDH10单抗免疫共沉淀复合物中有hTERT的存在，再一次验证两者的相互作用，证明质谱结果的真实性。2. PCDH10和hTERT相互作用对端粒酶活性的影响2.1腺病毒Ad-PCDH10的构建、包装及扩增采用RT-PCR从睾丸组织中扩增PCDH10基因全长片段，连接至中间载体pTA2，经酶切及测序鉴定正确；KpnI和XbaI同时双酶切PCDH10的基因序列和腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV，T4连接酶连接后连接产物转化感受态DH5α，获取重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-PCDH10；经PmeI线性化后在含pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态中进行同源重组，获得重组腺病毒载体pAdEasy-PCDH10；转染293T细胞进行包装、扩增，第5代获得滴度较高的腺病毒，命名为Ad-PCDH10。2.2PCDH10和hTERT相互作用对端粒酶活性的影响以端粒酶强阳性的体外培养肿瘤细胞为研究对象，腺病毒Ad-PCDH10和腺病毒空载Ad感染人胰腺癌细胞HS766T，同时设置未感染对照组。Real-Time PCR和Western Blotting分别检测HS766T细胞中PCDH10的mRNA和蛋白表达水平表明：转染PCDH10基因后，与腺病毒空载对照组和未感染对照组相比，PCDH10基因表达明显上调，蛋白表达明显增强(P<0.01)，证明腺病毒感染有效。(1) Real-Time PCR和Western Blotting分别检测HS766T细胞中hTERT的mRNA和蛋白表达水平表明：转染PCDH10基因后，hTERT的mRNA和蛋白表达水平较腺病毒空载对照组和未感染对照组无明显变化(P>0.05)，表明PCDH10对hTERT的表达没有影响；(2)以抗人PCDH10单抗免疫共沉淀HS766T细胞总蛋白，Western Blotting检测hTERT存在于转染PCDH10的免疫共沉淀复合物中，同时TRAP-非变性PAGE-银染法检测端粒酶活性提示：转染PCDH10基因组的端粒酶活性较腺病毒空载对照组和未感染对照组明显降低(P<0.01)，而后两者端粒酶活性无明显差异(P>0.05)，表明PCDH10与hTERT相互作用能明显抑制端粒酶活性。3. PCDH10对肿瘤细胞增殖、周期、迁移和侵袭等生物学特性的影响腺病毒Ad-PCDH10和腺病毒空载Ad感染HS766T，同时设置未感染对照组。3.1PCDH10转染对HS776T细胞增殖活性的影响转染PCDH10基因24h，48h，72h，96h，120h，144h后，CCK-8细胞增殖检测各组细胞增殖活性。结果显示：腺病毒空载对照组与未转染组比较，HS776T细胞增殖率无明显改变(P>0.05)，表明腺病毒空载体转染对HS776T细胞的增殖活性无影响；与腺病毒空载对照组相比，转染PCDH10组的细胞增殖率逐渐下降，表明PCDH10对HS766T细胞增殖起抑制作用，并呈时间依赖性，转染96h增殖率下降12.73%(P<0.05)；转染120h增殖率下降19.87%(P<0.01)；转染144h增殖率最低，抑制最强，下降30.14%(P=0.000)。3.2PCDH10转染对HS776T细胞周期的影响转染PCDH10基因72h，流式细胞仪DNA含量分析法检测各组细胞周期。结果显示：与未感染组和腺病毒空载组比较，PCDH10组细胞增殖期(S、G2/M期)细胞和静止期（G0、G1期）各细胞周期比例均无明显变化(P>0.05)，表明PCDH10对HS776T的细胞周期没有影响。3.3PCDH10转染对HS776T细胞迁移能力的影响转染PCDH10基因24h，48h后，采用细胞划痕实验测定细胞迁移能力。结果显示：与未感染组比较，腺病毒空载组24h和48h细胞的迁移率无明显差异(P>0.05)，表明腺病毒空载转染对HS776T细胞的迁移活性无影响；而转染PCDH10基因组划痕处的HS776T细胞的迁移明显受抑制，24h和48h细胞的迁移率较腺病毒空载对照组明显下降(P<0.01)，分别下降30.07%和52.95%(P=0.000)，表明PCDH10能明显抑制HS776T细胞的迁移能力。3.4PCDH10转染对HS776T细胞侵袭能力的影响转染PCDH10基因24h，采用Transwell实验测定细胞侵袭能力。结果显示：与未感染组比较，腺病毒空载组细胞24h穿过Matrigel胶及Transwell膜的细胞数无明显差异(P>0.05)，表明腺病毒空载体转染对HS776T细胞的侵袭活性无影响；而转染PCDH10基因组与腺病毒空载组相比，HS776T细胞侵袭重建基底膜能力受到显著的抑制，穿过Matrigel胶及Transwell膜的细胞数明显减少(P<0.01)，侵袭活性下降58.56%(P=0.000)，表明PCDH10能明显抑制HS776T细胞侵袭能力。结论：综上所述，本课题首次从正常人睾丸组织中成功筛选和鉴定出新的hTERT相互作用蛋白PCDH10，并在体内验证hTERT和PCDH10间存在相互作用；其次通过在端粒酶强阳性的肿瘤细胞中过表达PCDH10，体外实验初步阐明PCDH10对hTERT表达无影响，而它与hTERT相互作用抑制端粒酶活性；最后明确PCDH10在体外具有抑制肿瘤细胞生长，降低肿瘤细胞迁移和侵袭等细胞生物学效应；同时推测外源性过表达PCDH10可能通过增强与hTERT的直接相互作用，加强抑制端粒酶活性作用，进而抑制肿瘤细胞生长，降低肿瘤细胞迁移和侵袭，这可能是PCDH10抑癌的重要机制之一。复习文献，迄今未发现PCDH10与端粒酶有关的报道。因此，我们的研究首次明确PCDH10对端粒酶活性起抑制作用，为完善端粒酶活性调控机制提供了新的实验依据和研究方向，并为端粒酶在增龄相关性疾病的发病机理和防治机制以及制备治疗性生物工程细胞等方面提供了新的思路和线索。