论文部分内容阅读
目的：本课题通过观察高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）治疗小鼠H22移植性肝癌后局部热休克蛋白(Heat shock protein, HSP)表达的变化, 探讨HIFU治疗对肿瘤抗原递呈的影响。在此基础上, 进一步分离和纯化局部热休克蛋白-肽复合物, 并作为肿瘤疫苗免疫同种小鼠，激活免疫系统，观察特异性抗肿瘤免疫应答, 为阐明HIFU治疗后机体抗肿瘤免疫功能增强的机制提供实验室依据。方法：⑴ 20只接种H22瘤C57BL/6J系小鼠，随机分为HIFU组(n=10)及对照组(n=10)。HIFU组在接受HIFU治疗后即刻取肿瘤标本，对照组同一时间取标本。采用HE染色、电镜观察两组移植性肿瘤的组织学变化；SP免疫组织化学染色法分别检测两组肿瘤细胞HSP70及GP96的变化。⑵DEAE-cellulose52阴离子层析及ConA Sepharose 4B亲和层析分离提纯HSP70, SDS-PAGE和Western blot鉴定提取物。⑶100只C57BL/6J系正常小鼠随机分为5组，第1、第8天分别皮下注射下述物质，A组生理盐水10μg、B组H22肿瘤组织粗提物10μg、C组HIFU治疗后B16肿瘤组织粗提物10μg、D组HIFU治疗后H22肿瘤组织粗提物10μg、E组分离提纯的HSP7010μg；20只接种H22<WP=7>瘤C57BL/6J小鼠HIFU治疗后15天为F组。第15天每组取10只 小鼠脾脏分离淋巴细胞，MTT法检测H22细胞毒作用；另外10只分别皮下接种H22细胞2×106个，观察肿瘤发生率、肿瘤体积、转移发生率、生存曲线、生存率。 结果：⑴与对照组比较，HIFU组肿瘤组织出现凝固性坏死,肿瘤细胞的质膜结构受到明显的破坏。HIFU组HSP70阳性表达率为100%、对照组为30%, 差异有统计学意义，P< 0.05。两组GP96阳性表达率分别为70%、80%，无显著性差异, P＞0.05。⑵SDS-PAGE凝胶电泳及免疫印迹证实分离提纯物为目的蛋白，0.7cm~1.0cm的肿瘤约可以提纯50μg的HSP70。⑶ A～F组脾CTL对H22细胞的细胞毒活性分别为15.9%、30.7%、16.2%、37.5%、65.3%、62.7%。E组和F组CTL的细胞毒活性增加，与其它四组比较, 有显著性差异, P<0.05。E组和F组小鼠能够抵抗2×106个H22细胞攻击，随访期间未发现成瘤，而A~D组小鼠1周内肿瘤发生率分别为50%、40%、60%和50%；A～F组5周生存率分别为40%、30%、20%、30%，100%和100%。 结论：⑴ HIFU治疗后肿瘤细胞膜完整性被破坏，局部有HSP70的明显表达。⑵ HIFU治疗后1g肿瘤能分离提纯337μg HSP70，为刺激机体产生特异性免疫提供了足够的肿瘤抗原量。⑶ H22肝癌小鼠HIFU治疗后局部肿瘤HSP70-肽复合物具有生物学活性, 免疫同种小 <WP=8>鼠，能剌激免疫系统产生特异性抗肿瘤免疫应答。上述结果表明HIFU治疗后，残留坏死肿瘤中的HSP70-肽复合物可以作为肿瘤疫苗激活机体产生特异性抗肿瘤免疫反应。