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重组蛋白表达水平低是限制植物生物反应器应用的瓶颈之一,提高重组蛋白的表达水平一直是植物生物反应器应用基础研究的重要科学问题。通常提高重组蛋白的表达是通过提高转录水平和翻译水平,包括采用强启动子、优化5’和3’UTR、加强转录因子和选用定向分选信号肽等策略,但由于过量表达重组蛋白会诱导产生内质网胁迫（ER stress）,导致进一步提高重组蛋白表达量的效果不明显。根据大量研究表明,在细胞中过量表达重组蛋白可引起内质网胁迫,从而导致重组蛋白的降解,严重影响了重组蛋白表达量的进一步提高。虽然水稻胚乳已被证明是一个高效、经济的重组蛋白生产平台,但如何更进一步提高表达量,是亟待解决的科学问题。本研究主要针对在水稻胚乳细胞中过量表达重组蛋白诱导的内质网胁迫问题,就如何减轻内质网胁迫来提高重组蛋白产量开展研究,通过降低水稻胚乳内源蛋白含量,为重组蛋白提供更多的合成和储藏空间,进一步提高重组蛋白在水稻胚乳细胞中的表达量。本研究采用TALEN介导的基因定点敲除插入（Knock-in）技术,将HSA基因通过定点敲除插入的方式定点整合到水稻胚乳储藏谷蛋白Glu A1位点,达到敲除该储藏蛋白基因,同时该位点表达水稻源重组人血清白蛋白（Osr HSA）,来验证降低内源储藏蛋白是否可以提高Osr HSA的表达水平和缓解由于Osr HSA过量表达而产生的内质网胁迫。主要研究结果如下:1、选择水稻胚乳储藏谷蛋白表达量最高的基因位点Glu A1的第一个外显子作为定点敲除插入的靶点,并根据Glu A1的第一个外显子序列设计TALEN,按照水稻的密码子偏好合成了TALEN（Gt-TALEN）,然后利用Single Strand Annealing（SSA）Assay方法检测Gt-TALEN的靶点切割活性,经测试Gt-TALEN的靶点序列切割效率为0.79,表明Gt-TALEN具有很高的靶点切割活性。2、利用构建的pOs PMP623、pOs PMP624和pOs PMP625等三个农杆菌转化的表达质粒,分别采用pOs PMP624单独转化获得HSA基因随机整合（Ramdon Intergration,RI）转基因水稻作为对照;pOs PMP623与TALEN质粒pOs PMP625共转化获得HSA定向敲除插入（Knock-In,KI）转基因水稻的转化策略,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过Non-Homologous End Joining（NHEJ）途径将HSA基因定点敲除插入至Glu A1位点。经过PCR鉴定,单独转化获得了20株HSA基因随机整合的阳性植株;获得了11株共转化的HSA阳性植株,经PCR鉴定和对PCR产物测序确认,其中3株为HSA定点敲除插入,定点整合的频率为27.27%。3、对HSA随机整合和定点敲除插入转基因株系的Osr HSA表达量进行ELISA分析,3个KI株系的Osr HSA表达量为4.94-5.31 mg/g糙米,平均表达量为5.13±0.15 mg/g糙米,转化子间的CV值为2.93%。而在20个RI株系中Osr HSA表达量为0.13-2.39 mg/g糙米,平均值为1.03±0.60 mg/g糙米,转化子间CV值为58.3%。KI株系的Osr HSA平均表达量是RI株系中Osr HSA平均表达量的4.98倍,Osr HSA最高表达量是RI株系中Osr HSA最高表达量的2.22倍。结果表明本技术不仅显著地提高了水稻胚乳中Osr HSA的表达量,而且克服了随机整合给外源基因表达带来的位置效应。4、发现在水稻胚乳中高表达Osr HSA影响了水稻胚乳储藏蛋白的基因转录和蛋白积累。在m RNA水平上,与野生株系TP309相比,除敲除的Glu A1外,其余谷蛋白基因Glu A和Glu（B+C+D）在KI株系623-35-16中的m RNA水平上均发生了显著下调,尤其在开花授粉后12天时,分别下降了85.4%（P＜0.01）和59.0%（P＜0.01）,而醇溶蛋白和球蛋白在m RNA水平上发生了上调,在开花授粉后12天时分别提高了112.8%（P＜0.01）和102.3%（P＜0.01）。在蛋白水平上,谷蛋白和球蛋白显著下降,表明过量表达重组人血清白在翻译水平上影响球蛋白的表达;而醇溶蛋白则显著提高。结果显示过量表达Osr HSA降低了谷蛋白和球蛋白在胚乳细胞的积累,同时增加了醇溶谷蛋白的表达,提示水稻胚乳细胞对总蛋白含量具有很强的补偿机制。5、对分子伴侣0s Bi P1和内质网胁迫特异信号分子0s Bi P5的转录水平进行了分析,与TP309相比,发现KI株系623-35-16的0s Bi P1的m RNA水平在开花授粉后4天、8天和12天时分别提高了54.8%（P＜0.01）、480.1%（P＜0.01）和315.7%（P＜0.01）;与RI株系624-7-9相比,则是分别提高了37.4%（P＜0.01）、94.5%（P＜0.01）和6.8%（P＞0.05）。与RI株系624-7-9相比,KI株系623-35-16中0s Bi P5的m RNA水平在开花授粉后4天、8天和12天时分别提高了13.8%（P＞0.05）、50.1%（P＞0.05）和58.2%（P＜0.05）。结果表明过表达Osr HSA引起了严重的内质网胁迫;但在KI株系623-35-16中,内质网胁迫并没有依Osr HSA表达量提高而加重,提示降低内源储藏蛋白可以缓解内质网胁迫。6、对内质网胁迫通路中0sb ZIP50和0sb ZIP60的基因表达分析发现:与RI株系624-7-9相比,KI株系623-35-16中0sb ZIP50和0sb ZIP60均在开花授粉后12天时显著上调,分别提高了77.3%（P＜0.01）和39.7%（P＜0.01）,而0s Bi P1无显著性差异。进一步分析和比较了0sb ZIP50在623-35-16和624-7-9中的m RNA剪切程度,结果显示0sb ZIP50在两个株系的开花授粉后12天时均发生了m RNA的剪切,且623-35-16中的m RNA剪切程度比RI株系624-7-9更为明显。这表明623-35-16是通过更显著地上调IRE1/Osb ZIP50途径来缓解内质网胁迫。7、利用透射电镜对水稻胚乳中蛋白体（Protein Body,PB）的观察发现,与RI株系624-7-9相比,KI株系623-35-16中的蛋白体在形态上与野生株系TP309中的蛋白体更接近一致。8、我们发现与RI株系相比,KI株系胚乳中的谷蛋白前体显著增加,表明Osr HSA在胚乳中的高表达影响了谷蛋白前体的加工。综上所述,TALEN介导的“定点敲除插入”技术可以显著地提高重组蛋白的表达水平;提高Osr HSA产量的机理是降低内源储藏谷蛋白的表达量,减轻由重组蛋白高表达引起的内质网胁迫,并改善了重组蛋白在胚乳细胞中翻译后的加工和转运效率;揭示了在水稻胚乳中过量表达Osr HSA引起的内质网胁迫是通过上调分子伴侣Os Bi P1和内质网胁迫相关信号Os Bi P5基因表达,然后激活IRE1/Osb ZIP50途径来减轻内质网胁迫;进一步证实了水稻胚乳具有很强的蛋白补偿能力来维持胚乳细胞的总蛋白含量平衡（Protein Content Homostasis）,揭示通过减低内源蛋白含量来提高外源蛋白产量不会对水稻种子发育造成影响。