论文部分内容阅读
只能行寄生生活的病毒在物质循环以及宿主细胞的进化中发挥着重要作用,它们在整个三域生物中都大量存在,其数量大约是宿主的10-100倍。在以古菌为优势种群的各种极端环境中,病毒被认为是其中最主要的“捕食者”或“消费者”,通过电子显微镜观察也证实了大量病毒样颗粒的存在,最高密度甚至可达1.3×1010/m L。但与同属原核生物的细菌相比,迄今为止被报道并测序的古菌病毒只有约120株,数量上为细菌病毒（噬菌体）的1.4%,后者的研究报道种类已经超过8500株。此外,目前报道的古菌病毒大多为分离于自然环境的烈性病毒,人们对古菌温和病毒的认识更是处于起步阶段。本文的研究对象为极端嗜盐古菌Natrinema sp.J7-1中的温和病毒SNJ1（Saline Natrinema sp.J7-1 virus 1）。该病毒的基因组为双链环状DNA,属于球脂病毒科（Sphaerolipoviridae）。在溶源状态下原病毒以质粒形式（早期称为p HH205质粒）独立存在于染色体外,在丝裂霉素C（mitomycin C,MMC）诱导时大量合成子代病毒并释放到胞外。本课题组前期在对J7-1进行实验的过程中,偶然获得了不含SNJ1原病毒的自愈菌株,命名为Natrinema sp.CJ7。当用SNJ1病毒分别侵染CJ7和J7-1菌株时,发现其只在CJ7菌株铺制的双层平板上形成噬菌斑,而J7-1平板上则没有噬菌斑。这表明溶源在J7-1中的SNJ1可以免疫同种病毒的二次侵染,即“超感染免疫现象（superinfection immunity）”。超感染免疫的作用机制在真核病毒及噬菌体中已得到深入研究,然而古菌中仅有φH和SIRV2两株病毒报道过该现象,并且其作用机制和调控因子尚且未知。前期工作证实,用p FJ6载体表达SNJ1的1-656 bp片段可使CJ7-F菌株（CJ7的尿嘧啶营养缺陷型菌株）免疫病毒的侵染。1-656片段含有两个共转录的基因orf3和orf4,本研究通过对这两个基因进行移码突变,证明只有ORF4是超感染免疫的必须蛋白,ORF3并不参与该过程。ORF4包含68个氨基酸残基,经生物信息学分析发现其与Spo VT/Abr B家族的转录调控因子具有同源性,可能通过swapped hairpin结构形成二聚体并发挥作用。通过对ORF4蛋白的不断截短,发现其N端33个氨基酸残基是具有超感染免疫功能的最小序列。接下来,为了阐明ORF4发挥超感染免疫作用的机制,我们将SNJ1分别侵染CJ7、J7-1、CJ7-F/p FJ6-MCS、CJ7-F/p FJ6-Hpro-orf4这四株菌（Hpro:Haloferax volcanii DS52菌株hsp70基因的启动子）,然后检测病毒的吸附、基因组进入、DNA复制和释放过程是否受ORF4的影响。结果发现,SNJ1对这四株菌的吸附效率相似,说明ORF4并不影响病毒的吸附过程。但是在感染初期（感染1 h后）,进入到胞内的SNJ1基因组拷贝数被ORF4抑制,在含有ORF4的细胞中病毒基因组的拷贝数仅是不含ORF4细胞的10%。而且随着感染时间的延长,含有ORF4的细胞中SNJ1基因组拷贝数一直处于较低水平,在感染9 h后仅为不含ORF4菌株的2%。这说明ORF4的存在显著抑制了病毒DNA的复制过程。最终相比于CJ7和CJ7-F/p FJ6-MCS菌株,含有ORF4的J7-1和CJ7-F/p FJ6-Hpro-orf4菌株中,SNJ1子代病毒的释放量下降了约100倍。另外ORF4还调控了SNJ1溶源与裂解途径的转变。当ORF4表达时,SNJ1处于溶源状态,基因组以低拷贝的形式（约2个拷贝）稳定地存在于细胞中。而ORF4突变或缺失的SNJ1病毒则彻底丧失溶源状态,成为烈性病毒,胞内基因组拷贝数也显著升高（约10倍）。这说明ORF4是通过抑制原病毒基因组的复制来维持SNJ1的溶源状态。MMC诱导也会导致SNJ1从溶源转为裂解途径,这表明在MMC诱导后ORF4很有可能失去活性,从而解除了其对基因组复制的抑制,使SNJ1进入裂解途径。接下来为了探索ORF4抑制基因组复制的方式,我们对ORF4和SNJ1最小复制区内基因（orf5-rep A）的调控关系进行了分析。通过启动子活性检测,我们发现ORF5和ORF6是复制-转录相关基因orf7-rep A的转录激活因子;而异源表达的结果显示ORF4抑制了orf5-orf6的转录。因此ORF4很可能作为转录的负调控因子抑制了SNJ1基因组的复制过程,进而使其维持在溶源状态并免疫病毒的二次侵染。通过生物信息学比对发现了两个SNJ1-like的质粒,分别是Natrinema versiforme strain BOL5-4的p NVE19质粒和Haloterrigena jeotgali strain A29的unnamed5质粒。这两个质粒无论是DNA还是蛋白质序列都与SNJ1有很高的相似度,并且基因的排布顺序几乎一致,因此我们推测它们可能是两个属于Sphaerolipoviridae科的原病毒基因组或其残片。ORF4蛋白在SNJ1-like的原病毒中高度保守,蛋白质一致性高达76%以上,这暗示着在这些原病毒中ORF4-like蛋白也是其生活周期的关键调控蛋白。综上所述,ORF4是古菌病毒中首个被证实能同时调控超感染免疫现象和溶源/裂解转变过程的蛋白,本文揭示了该蛋白对SNJ1生活周期的调控机制,丰富了人们对古菌病毒及其与宿主相互作用的认识。