花生(Arachis hypogaea L.)种子特异性启动子的克隆及功能分析

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花生(Arachis hypogaea L.)是世界上重要的油料作物之一。启动子是位于基因5’端上游被RNA聚合酶特异性识别并结合的一段DNA序列,是调控下游基因表达特性的重要元件。通过对花生种子特异性启动子的研究,有利于了解花生油脂合成及种子发育分子机制,对花生的遗传与改良具有重要意义。鉴定花生种子特异性基因(Seed-specific genes,SDGs)是获得种子特异性启动子(Arachis hypogaea Seed-specific promoters,Ah SDPs)的前提。研究取得的主要结果如下:1.为了挖掘种子特异性候选基因,对花生荚果中不同时期的子叶和非子叶的7类组织进行了转录组测序。根据转录组数据分析,以FPKM数值0.1作为判断基因是否表达的阈值,最终获得了291个种子特异性候选基因。对其中42个进行半定量RT-PCR鉴定,并标注为SDG1-SDG42,进一步确定其中19个候选基因在种子中特异性表达。2.通过Peanut Base将SDG1、SDG2、SDG5、SDG9、SDG14、SDG13和SDG16等7个候选基因与栽培种花生Tiffrunner基因组进行比对,最终在栽培种花生豫花9326中克隆到了对应的7个启动子,分别为Ah SDP1、Ah SDP2、Ah SDP5、Ah SDP9、Ah SDP14、Ah SDP13和Ah SDP16。通过Plant Care在线分析显示,克隆到的启动子除了含有核心调控元件TATA-BOX和CAAT-BOX之外,还有多个非生物胁迫作用元件,如茉莉酸响应元件、干旱胁迫响应元件、光响应元件和干旱诱导的MYB结合位点等,其中Ah SDP2、Ah SDP5、Ah SDP9、Ah SDP14、Ah SDP13和Ah SDP16等6个启动子含有与种子特异性表达有关的顺式作用元件RY-REPEAT。3.通过对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,进而验证7个启动子的种子特异性,结果显示Ah SDP5、Ah SDP9、Ah SDP13和Ah SDP16仅在种子中观察到了蓝色,证明上述启动子属于种子特异性启动子。本研究通过花生荚果中子叶与非子叶组织的比较转录组测序及半定量RT-PCR验证,获得了291个种子特异性候选基因,对SDG1、SDG2、SDG5、SDG9、SDG14、SDG13和SDG16进行启动子克隆及功能验证,结果表明Ah SDP5、Ah SDP9、Ah SDP13和Ah SDP16属于种子特异性启动子。这项工作中所确定的花生种子特异性启动子可以运用于花生的遗传改良中。
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