条件培养液促CEC增殖及诱导BEPC向CEC分化的研究

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目的:  探讨条件培养液对角膜内皮细胞(CEC)的促增殖作用,以及条件培养液诱导骨髓内皮祖细胞(BEPC)向CEC分化的可能性,并对比不同条件培养液之间的作用差异,为角膜内皮失代偿的治疗提供新的思路和实验基础。  方法:  1、体外分离培养大鼠CEC、BEPC、骨髓间充质干细胞(BMSC)、角膜基质细胞(CSC)并制备条件培养液(CM),收集大鼠CSC、BEPC、BMSC条件培养液,根据条件培养液的来源将实验为四组(CONTROL、CSC-CM、BEPC-CM、BMSC-CM)分别对CEC进行增殖培养。观察记录CEC生长状态,通过免疫细胞化学技术(ICC)及定量聚合酶链反应(qPCR)检测CEC活性相关标志物的表达水平,使用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测CEC增殖情况,对比不同条件培养液促CEC增殖的作用。  2、体外培养大鼠BEPC、CEC、晶状体上皮细胞(LEC),制备大鼠CEC、LEC、1:1 CEC与LEC条件培养液,实验分为四组(CONTROL、CEC-CM、LEC-CM、CL-CM)分别对BEPC进行诱导培养。记录BEPC增殖分化状态,通过ICC及qPCR检测BEPC诱导前后所表达与CEC相关的标志物的水平,并对BEPC的增殖情况进行检测,对比不同条件培养液对BEPC分化为CEC的诱导作用。  结果:  1、不同条件培养液培养5天后的CEC形态无明显改变,呈多边形且分布均匀。Na+/ K+-ATP、AQP1、ZO-1在各组细胞中表达均为阳性,其中Na+/ K+-ATP在CSC-CM中表达水平上升,ZO-1在BMSC-CM中表达水平显著上升。COL8A1在CSC-CM及BMSC-CM中的表达水平显著上升。BEPC-CM、CSC-CM、BMSC-CM三种条件培养液都对CEC的增殖起促进作用,其中CSC-CM的促增殖作用最明显。  2、经不同条件培养液诱导培养后,各实验组BEPC细胞分布较均匀,形成细胞接触抑制,且细胞形态向类多边形转化。角膜内皮细胞的相关标志物NSE、PAX6、ZO-1、AQP1、COL8A1、VDAC3、CLCN3的表达水平在CEC-CM的诱导下均有不同程度的上升。与LEC-CM和CL-CM相对比,BEPC在CEC-CM诱导下的增殖能力最强。  结论:  1、角膜基质细胞、骨髓内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞条件培养液对角膜内皮细胞的增殖均有促进作用,其中角膜基质细胞条件培养液的促增值作用最明显。  2、骨髓内皮祖细胞在角膜内皮细胞、晶状体上皮细胞条件培养液的诱导下能够发生类角膜内皮细胞样改变,角膜内皮细胞条件培养的作用尤其明显,更适于深入研究其诱导机制。
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