疼痛是当前严重困扰人类健康的生物医学难题之一。疼痛诱发因素多样化,如机体组织损伤、炎症、情绪失控、运动感觉障碍、遗传突变、肿瘤等均可改变痛觉感受、传递、整合的个体自我保护和内在适应的可塑性,所呈现的持续性、慢性化、个性化在多层面制约着临床预防、诊断、治疗策略的有效选择。疼痛表症多样化,如除在躯体损伤部位表现持续自发痛、原发性痛敏和损伤部位周围区域出现继发性痛敏外,在损伤部位同体节的对侧对称部位亦出现所谓“镜像痛敏”。然而,迅猛发展、高潮迭起的疼痛调控研究仍缺乏对诸如镜像痛敏等复杂表症发生、发展和维持机制的系统理解。缝隙连接通道及半通道介导神经与胶质的胞间通讯互作,且具有蛋白亚型、细胞表达分布、磷酸化功能调控的多样性,尤其在疼痛等疾病调控的相关性机制是前沿热点。本论文工作基于蝎毒素多肽类特异性钠通道激活剂——Bm K I诱发镜像痛敏动物模型,采用行为药理学、实时荧光定量PCR、免疫组化和免疫印迹等方法探究外周和中枢缝隙连接蛋白亚型及其磷酸化动态调控与镜像痛敏发生、发展和维持的相关分子与细胞机制。主要结果如下:1.脊髓和背根神经节连接蛋白亚型的差异性表达分布采用实时荧光定量PCR方法发现,大鼠脊髓和背根神经节(DRG)中连接蛋白亚型表达分布差异较大。脊髓中主要表达Cx47、Cx45、Cx43、Cx36、Cx32、Cx30、Cx29和Cx26;DRG中主要表达Cx45、Cx43、Cx39、Cx37、Cx36、Cx32、Cx31.1、Cx31、Cx30、Cx29和Cx26。且脊髓和DRG中同一连接蛋白表达丰度存在差异。提示,缝隙连接蛋白的表达和功能调控具细胞表达差异性。2.Connexins以开放和表达量改变参与镜像痛敏的发生、发展和维持预先鞘内注射缝隙连接通道开放抑制剂CBX、GA或Cx43特异拟似肽Gap26均可剂量依赖性显著抑制大鼠单侧后足底皮下注射Bm K I诱发的自发痛、长时程双侧机械镜像痛敏。这些行为学证据表明,关闭或抑制缝隙连接通道缓减疼痛发生、发展和维持。进一步的定量检测发现,随疼痛时程的发展变化,脊髓双侧Cx36呈现“n”型,双侧Cx43呈“v”型,同侧Cx 32呈“n”,而对侧呈“v”型;DRG中三者均呈现先增后降趋势。因此,脊髓和DRG双侧各连接蛋白亚型表达呈现左右并不完全相同的“时间窗口”。无论脊髓或DRG,三种Connexins的表达变化趋势均可被缝隙连接通道抑制剂CBX不同程度地逆转。结果表明,缝隙连接蛋白通过开放与关闭的通道功能或表达量的变化参与镜像痛敏发生、发展和维持的调控,而Cx43作用尤为重要。3.Connexins亚型细胞定位分布与镜像痛敏发生、发展和维持在脊髓,Cx32在脊髓背角均匀分布,均与神经元标记蛋白Neu N、星形胶质细胞GFAP和小胶质细胞Iba1具不同程度共标。Cx36则主要分布在脊髓背角深层,与Neu N共定位在一起,少量与GFAP及Iba1共标。Cx43主要与GFAP共标,少量与Iba1共标,与Neu N无共标。随着疼痛发生发展,脊髓背角浅层Cx43与GFAP共标率呈逐渐上升趋势,而深层长时程保持高水平增加状态。在DRG中,Cx43、Cx36和Cx32阳性与NF200均有不同程度共定位;Cx32与IB4阳性神经元共标,与CGRP神经元几乎不共标;Cx43和Cx36阳性与IB4和CGRP均有不同程度共标;Cx43、Cx36和Cx32与卫星胶质细胞GFAP和小胶质细胞Iba1均有不同程度共标。预先给予缝隙连接通道抑制剂CBX显著降低脊髓和DRG connexin与标记蛋白共标率。结果表明,脊髓背角和DRG connexins表达分布的动态差异变化与镜像痛敏发生、发展和维持密切相关,缝隙连接蛋白亚型可作为疼痛相关细胞分型的新方式。4.Cx43磷酸化调控镜像疼痛的发生、发展和维持免疫印迹结果显示,疼痛刺激诱致脊髓和DRG中Cx43磷酸化水平显著变化。在脊髓,同侧p Cx43(Ser262)磷酸化位点呈现“v”型变化,p Cx43(Tyr265)磷酸化位点呈现“n”型变化,p Cx43(Ser279/282)和p Cx43(Ser368)磷酸化位点呈现递增趋势;对侧均呈现递增趋势。在DRG,p Cx43(Ser368)磷酸化同侧呈“n”型变化,而对侧逐渐降低。上述变化趋势均可被预先鞘内注射缝隙连接抑制剂CBX抑制,但各位点之间仍呈现较大差异。结果表明,脊髓和DRG中Cx43磷酸化调控镜像痛敏发生、发展和维持,且疼痛发生、发展和维持不同阶段参与的磷酸化调控位点显著不同。结论:脊髓和背根神经节connexins和磷酸化在机体损伤侧和对侧不对称的时空表达差异,调控镜像痛敏的发生、发展和维持。