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目的: 白细胞介素-1受体相关激酶-2(IRAK2)是Toll样受体(TLR)介导的信号通路中重要的蛋白激酶和调节分子,但其功能和作用机理还不完全清楚。本研究利用IRAK2基因敲除小鼠和同背景野生型小鼠,探讨IRAK2在TLR4和TLR9介导的信号通路中的功能及对前炎症细胞因子的调节机制。首先阐明IRAK2对内毒素所致脓毒性休克的作用,进而将小鼠骨髓干细胞分化为巨噬细胞(BMMs),研究IRAK2在TLR4介导的信号通路中的功能及其对前炎症细胞因子的调节机制;鉴定IRAK2的激酶活性并研究其在TLR4介导的信号通路中的功能和调节前炎症细胞因子的机制。在TLR9介导的信号通路中,利用胞浆样树突状细胞,研究IRAK2在DNA病毒感染和CpG诱导的前炎症细胞因子及干扰素中的作用;并利用BMMs,研究IRAK2对TLR9介导基因表达普及NF-κB活化的影响,进一步阐明IRAK2在TLR9介导的信号通路中的功能。由于IRAK2在TLRs介导的炎症反应和机体自身修复中发挥关键作用,对IRAK2调节炎症反应机制的阐明,有望为炎症治疗开辟新的途径;同时,作为重要的蛋白激酶,IRAK2本身亦可能成为一个很有潜力的治疗靶点。 方法: 将LPS按20mg/kg注射到野生型和同背景IRAK2基因敲除小鼠腹腔,比较野生型和IRAK2基因缺失小鼠对LPS引起的脓毒性休克而导致死亡率的差别,并检测注射LPS的小鼠(4mg/kg)血清中前炎症细胞因子IL1β、IL6、TNFα的浓度,以评价 IRAK2在内毒素所致脓毒性休克中的作用;将小鼠骨髓干细胞在体外分化为巨噬细胞(BMMs),采用 ELISA技术检测 LPS和R848诱导的BMMs培养上清中Il6、KC和TNFα的浓度,初步确定IRAK2在TLR4和TLT7介导的信号通路中的功能;进一步采用Realtime PCR,检测IRAK2在TLR4介导的前炎症细胞因子mRNA稳定性中发挥的作用;并用多聚核糖体分离技术将LPS诱导表达的mRNA分为具有翻译活性和没有翻译活性的两相,结合Realtime PCR分别检测两相中mRNA的量,以评估IRAK2对TLR4介导的前炎症细胞因子mRNA翻译水平的调节作用;然后构建野生型 IRAK2(IRAK2-WT)及IRAK2的ATP结合位点突变体(IRAK2-KD)的逆转录病毒表达系统,包装病毒后感染IRAK2基因敲除的BMMs,使外源IRAK2高表达以重建其功能,并采用该细胞模型来鉴定 IRAK2的激酶活性和研究其激酶活性与下游底物活化之间的关系,探讨IRAK2激酶活性在TLR4信号通路中对前炎性因子的调节作用。 利用鼠疱疹病毒68(MHV68)感染或者用CpG A刺激小鼠胞浆细胞样树突状细胞(pDC),检测细胞培养上清中I型干扰素(IFNα和IFNβ)、TNFα和KC的浓度,初步了解在DNA病毒感染或TLR9信号通路中,IRAK2对干扰素和前炎症细胞因子的调节功能;然后在CpG A刺激pDC的多个时间点(包括早期和晚期)检测IFNα和IFNβ的mRNA表达,并制备CpG A刺激pDC的核提取物,western blot检测 CpG A刺激下 IRF7的核转位,作为激活 I型干扰素表达的指标;用western blot检测IκBα、P38、ERK和JNK的磷酸化,以观察IRAK2在TLR9信号通路中对NF-κB和MAP激酶信号激活的作用;进一步在BMMs中,研究IRAK2对TLR9介导的NF-κB和MAP激酶信号激活、对TNFα表达和分泌的影响,比较野生型和IRAK2缺失BMMs中基因表达普的差别,以及IRAK2与其他信号分子之间的相互作用,探讨IRAK2对TLR9介导的前炎症细胞因子的调节机制。 结果: IRAK2基因缺失小鼠在腹腔注射20mg/ml的LPS后7天仍有80％以上存活,而相应的野生型小鼠则不到20%存活,显示IRAK2基因缺失小鼠对LPS诱导的脓脓毒性休克耐受,且IRAK2基因缺失小鼠血清中的前炎症细胞因子IL1β、IL6、TNFα的浓度比野生型小鼠低;BMMs在LPS和R848刺激下,IRAK2缺失的细胞产生的细胞因子(IL6、TNFα)和趋化因子(KC,即 CXCL1)比野生型细胞明显减少;BMMs在LPS诱导1.5h后,野生型和IRAK2缺失细胞表达的mRNA水平接近,但在放线菌素D处理阻断基因转录后,IL6和KC的mRNA在IRAK2缺失的BMMs中降解的速度比野生型细胞快;在翻译水平上,在IRAK2缺失的BMMs中检测到具有翻译活性的mRNA所占总 mRNA的百分比低于野生型细胞,同时,在IRAK2缺失的BMMs中,有翻译活性mRNA跟无翻译活性mRNA的比率亦低于野生型细胞;LPS诱导的MKK3/6、MnK1和eIF4E的磷酸化及TTP的修饰与稳定性在IRAK2缺失的BMMs亦下调,这可能是导致mRNA的稳定性和翻译活性下降,从而导致前炎症因子的产生减少的原因。体外激酶试验显示IRAK2具有激酶活性,并且依赖LPS的刺激而增强;用逆转录病毒系统将外源IRAK2导入IRAK2基因缺失BMMs后,细胞恢复了对TLR配体刺激产生前炎症细胞因子的功能,但表达IRAK2-WT比表达IRAK2-KD的BMMs产生的IL6、KC和TNFα多;在mRNA稳定性和翻译水平上,表达IRAK2-KD的BMMs比表达IRAK2-WT的BMMs均有明显的降低。 MHV68感染IRAK2缺失pDCs比野生型细胞产生更多干扰素,且TLR9介导IRF7的核转位和干扰素产生及IκBα、P38、ERK和JNK的磷酸化也在IRAK2缺失的pDCs增加,但前炎症细胞因子TNFα和KC在IRAK2缺失的pDCs的分泌比野生型细胞少;基因表达谱分析显示:在TLR9的配体CpG B诱导2h后,IRAK2缺失的巨噬细胞和野生型细胞相比,大部分基因表达增高,而TLR7的配体R848诱导的基因表达在IRAK2缺失的巨噬细胞中则减少;定量PCR的结果显示:虽然IRAK2缺失的巨噬细胞在CpG刺激的早期(0.5、1和2h)KC和TNFα的mRNA表达比野生型细胞多,但在后期(4h)却由于降解更快而比野生型细胞少,所以IRAK2缺失的巨噬细胞产生的TNFα、KC和IL6比野生型巨噬细胞少;此外,野生型BMMs表达TNFα的百分率比IRAK2缺失的细胞高,但分泌的TNFα却比IRAK2缺失的细胞少;BMMs在R848刺激下,IRAK2与MyD88和TRAF6均发生相互作用,但在CpG B作用下,IRAK2与TRAF6只有极微弱的结合,而与MyD88则没有相互作用,且没有观察到IRAK2自身的修饰。 结论: IRAK2缺失导致TLR4、TLR7和TLR9介导的前炎症细胞因子产生减少;IRAK2及其蛋白激酶活性通过参与TLR4介导的MAPK信号通路,在转录后水平促进前炎症细胞因子的表达;IRAK2为DNA病毒诱导干扰素表达的负调节因子;IRAK2在TLR9介导的信号通路中通过活化IRF7和基因转录对干扰素的产生进行负调节,但在转录后水平促进TLR9介导的细胞因子和趋化因子表达。