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研究背景与目的结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是全世界最常见的消化道疾病之一,其发病率及死亡率分别位于恶性肿瘤第三位和第四位。目前,CRC的治疗方式主要以手术切除为主,并辅以放化疗及靶向治疗。虽然CRC的治疗手段在不断完善,但其晚期患者的5年生存率仅10%,依然严重威胁人类健康。因此,开展对CRC更广泛、深入的研究具有重要意义。S100A9蛋白是S100家族成员,其主要在中性粒细胞中表达,并作为一种分泌型炎症因子参与炎症反应。已知S100A9在多种肿瘤中高表达,并促进肿瘤发展;课题组前期研究也证实了S100A9在CRC组织中高表达,并在体外实验中发现其具有直接促进CRC细胞生长及迁移的效应。同时,S100A9也被认为是髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)的一个重要标志物。研究表明,MDSCs是肿瘤免疫治疗的一个阻碍。MDSCs是一群高度异质性且未分化成熟的骨髓细胞,作为重要的免疫抑制细胞,其主要通过抑制局部微环境中的免疫T细胞及NK细胞功能,从而促进炎症、肿瘤等多种疾病的发展。在结直肠癌、膀胱癌等病人的外周血和肿瘤组织中的浸润中,MDSCs均增加。尽管MDSCs的免疫抑制功能已明确,但与其功能发挥相关的分子及其机制尚待阐明。因此,深入探讨CRC外周血中S100A9水平、MDSC频数及其相关性以及CRC微环境中这些细胞和蛋白质分子之间的相互关系可望发现它们在CRC诊治中的潜在应用价值。基于上述,本课题以S100A9及MDSCs为研究对象,检测了CRC患者外周血中MDSCs频数及血清S100A9的含量,并进一步分析了它们之间的相关性以及这两个指标对CRC潜在的诊断价值;同时,深入探讨S100A9对人结直肠癌细胞LoVo诱导形成的MDSCs的调控作用及机制。本研究为阐明CRC微环境中S100A9、癌细胞和MDSCs之间复杂的相互作用及其对CRC进展的影响和机制积累了实验依据,同时也为CRC的临床诊治提供了新的候选标志物及干预靶点。方法1.患者CRC组织及血清中S100A9的水平及MDSC的频数检测1-1通过免疫组织化学技术(IHC)检测CRC组织及癌旁组织中S100A9的表达以及CD33~+细胞的浸润。1-2通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CRC患者(n=52)及健康对照组(n=30)血清中S100A9的水平。1-3采用淋巴细胞分离液分离CRC患者及健康对照组的外周血单个核细胞,并通过流式细胞术(FCM)检测CRC患者及健康对照组外周血中MDSCs的频数。1-4应用Spearman r相关统计法分析CRC患者血清S100A9水平及MDSCs频数之间的相关性。1-5采用ROC曲线分析S100A9及MDSCs两个指标对CRC的诊断价值。2.重组人融合蛋白GST-人S100A9(简称:GST-S100A9)的制备与鉴定:通过原核表达的方式制备GST-S100A9和GST蛋白,采用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色及Western blot对其进行鉴定后,分装保存于-80℃备用。3.MDSCs的体外诱导和鉴定:收集CRC患者外周血并采用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞(PBMC),通过磁珠法筛选出CD33~+细胞并与人结直肠癌细胞系LoVo细胞共培养48h,收集该细胞进行鉴定,并用于后续实验,此即LoVo诱导的MDSCs,简称LoVo-MDSCs。4.S100A9对LoVo诱导的MDSCs的增殖、迁移及活化的影响4-1采用CCK8检测GST-S100A9对LoVo-MDSCs增殖能力的影响;4-2采用Transwell迁移试验检测GST-S100A9对LoVo-MDSCs迁移能力的影响;4-3探讨S100A9对LoVo-MDSCs的活化作用:GST-S100A9处理LoVo-MDSCs 24h后,用实时定量PCR检测其活化分子Arg1,iNOS及IL-10的mRNA水平;用荧光免疫酶标仪检测其中ROS水平;在Transwell共培养体系中将LoVo-MDSCs与CD8~+T细胞共培养,分别用GST-S100A9及GST处理48h后,应用FCM检测CD8~+T细胞的增殖活性,以反映S100A9对MDSCs功能(即抑制CD8~+T细胞增殖)的影响。5.S100A9促LoVo-MDSCs迁移和活化的机制探讨5-1 GST-S100A9处理LoVo-MDSCs后,通过Western blot检测细胞中可能相关的信号通路分子的总蛋白、相应的磷酸化蛋白的水平变化,包括TLR4、RAGE、p65/p-p65、p38/p-p38、ERK/p-ERK、JNK/p-JNK和AKT/p-AKT。5-2分别用TLR4抑制剂TAK-242、RAGE抑制剂FPS-ZM1、p65抑制剂BAY11-7082及p38抑制剂SB203580单独或联合GST-S100A9处理LoVo-MDSCs后,检测其迁移能力及活化状态的改变。结果1.CRC患者组织及外周血中S100A9的表达及MDSCs的频数。1-1 CRC患者肿瘤组织中S100A9的表达及CD33~+细胞的浸润均高于癌旁组织;外周血中S100A9的水平以及MDSCs的频数均高于健康对照组(P<0.001)。1-2 CRC患者外周血中增加的S100A9水平与MDSCs频数呈正相关。1-3 CRC患者外周血中S100A9的水平及MDSCs的频数均与肿瘤的Dukes分期(P<0.01和P<0.001)和淋巴结转移(P<0.01)相关,而与肿瘤发生部位、肿瘤的分化无关。2.ROC曲线结果显示血清S100A9和MDSCs对CRC有良好诊断效能,特别是对CRC的分期及淋巴结转移有较好的诊断价值。提示S100A9与MDSCs具有成为CRC临床诊断标志物的潜在价值。3.成功制备后续实验所需的重组蛋白GST-S100A9和对照蛋白GST;用LoVo处理48h后的CD33~+细胞即LoVo-MDSCs。4、S100A9对LoVo-MDSCs的增殖、迁移及活化的影响4-1 GST-S100A9对LoVo-MDSCs的增殖无明显影响(P>0.05)。4-2 GST-S100A9能促进LoVo-MDSCs的迁移及活化(P<0.05)。5、S100A9促进LoVo-MDSCs迁移及活化的分子机制5-1 GST-S100A9处理LoVo-MDSCs后,细胞的TLR4及RAGE的mRNA及蛋白质水平均增加(P<0.01)。5-2 RAGE抑制剂FPS-ZM1能够逆转S100A9对LoVo-MDSCs迁移的促进作用(P<0.05);TLR4抑制剂TAK-242能够逆转S100A9上调LoVo-MDSCs的活化分子Arg-1、iNOS和IL-10及对T细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。上述结果提示RAGE介导S100A9对LoVo-MDSCs迁移的促进作用,而S100A9促进LoVo-MDSCs活化的作用是经由TLR4介导的。5-3 GST-S100A9处理LoVo-MDSCs后,p-p38和p-p65均增加(P<0.05)。5-4 p38抑制剂SB203580能够逆转S100A9对LoVo-MDSCs迁移的促进作用(P<0.05);NF-κB抑制剂BAY11-7082能够逆转S100A9上调LoVo-MDSCs活化分子Arg-1、iNOS和IL-10以及抑制T细胞增殖的作用(P<0.05)。上述结果提示S100A9分别通过激活RAGE/p38/MAPK和TLR4/p65/NF-κB信号通路促进LoVo-MDSCs的迁移和活化。结论1.CRC患者中S100A9及MDSCs的水平均增加,且两者之间存在正相关性。2.血液中S100A9水平和MDSCs频数均与CRC分期、有无淋巴结转移有良好相关性,是CRC临床诊治的潜在标志物。3.S100A9可促进CRC诱导的MDSCs的迁移,其机制涉及RAGE/p38/MAPK信号通路的激活。4.S100A9可促进CRC诱导的MDSCs的活化,其机制涉及TLR4/p65/NF-κB信号通路的激活。