论文部分内容阅读
目的研究不同浓度的中药单体淫羊藿苷(Icariin)对人软骨肉瘤细胞SW1353细胞生存率的影响，筛选最佳药物浓度；研究最佳浓度淫羊藿苷对IL-1β诱导后SW1353细胞的基质金属蛋白酶（MatrixMetalloproteinase，MMP）1、3、13表达的影响；研究最佳浓度淫羊藿苷对IL-1β诱导后的MAPKs信号通路（p38信号通路、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路）以及Wnt/β-catenin信号通路的影响；研究淫羊藿苷对实验性大鼠膝骨关节炎（Osteoarthritis, OA）模型关节软骨组织形态、MMPs、MAPKs信号通路以及Wnt/β-catenin表达的影响；探讨淫羊藿苷对OA软骨降解的保护作用及可能涉及的机制。方法1.体外实验1.1设定7个药物浓度（0、5、10、20、40、80、100μM），四甲基偶氮唑蓝（MTT）测试和Western Blot (WB)检测不同浓度的Icariin对SW1353细胞生存率以及对MMP-1、3、13表达的影响，分析筛选最佳药物浓度。1.2以IL-1β诱导SW1353细胞，以Icarrin干预，采用实时荧光定量逆转录多聚酶链反应（q-PCR）法及酶联免疫吸附（ELISA）方法检测细胞及细胞上清液中MMP-1、3、13mRNA和蛋白水平的表达。1.3以IL-1β诱导SW1353细胞、淫羊藿苷为干预，免疫荧光及WB方法检测磷酸化p38（P-p38）、磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）、磷酸化JNK（P-p54，P-p46）以及β-catenin的表达。1.4以IL-1β诱导SW1353细胞，以淫羊藿苷为试验药物，以p38特异性抑制剂SB203580，ERK1/2选择性抑制剂PD98059，JNK特异性抑制剂SP600125，以及β-catenin特异性抑制剂XAV-939为对照分别阻断p38，ERK1/2，JNK以及Wnt/β-catenin信号通路，WB方法检测细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13、P-p38、P-ERK1/2、P-JNK以及β-catenin的表达。2.体内实验2.1成年SD雄性大鼠70只，随机选取10只作为正常对照组，其余采用国际公认的Hulth法建立大鼠膝骨关节炎（KOA）动物模型，并随机分为模型对照组、淫羊藿苷组、SB203580组、PD98059组、SP600125组以及XAV-939组。造模后4周，除正常对照组外，模型对照组予以DMSO（0.3mL，0.05%），其余各组分别予以相应剂量淫羊藿苷（0.3mL，20μM）、SB203580（0.3mL，10μM）、PD98059（0.3mL，10μM）、SP600125（0.3mL，10μM）及XAV-939（0.3mL，10nM）膝关节腔内注射，每周1次，持续6周。通过Mankin·s评分及HE染色观察不同组别大鼠膝关节软骨组织形态学改变。2.2免疫组织化学法及Western blot方法检测各组软骨组织中MMP-1，3，13的表达。2.3WB方法检测各组软骨组织中P-p38、P-JNK、P-ERK1/2以及β-catenin的表达。结果1.体外实验1.1不同浓度Icariin对SW1353细胞生存率的影响MTT结果显示，0、5、10、20μM Icariin干预SW1353细胞，细胞生存率＞90%，对细胞生存无影响；40、80、100μM Icariin干预SW1353细胞，细胞生存率＜90%，对细胞生长有抑制作用。Icariin能显著下调IL-1β诱导的细胞MMP-1、3、13表达，且呈剂量依赖性。因此，在后续实验中，我们采用20μM作为Icariin干预浓度。1.2Icariin对IL-1β诱导的SW1353细胞MMP-1、3、13mRNA和蛋白表达的影响SW1353细胞以20μM Icariin预处理1h，再加入10ng/mL IL-1β，收集细胞及上清液行q-PCR及ELISA检测。与IL-1β组相比，Icariin组MMP-1、3、13mRNA表达水平明显降低。ELISA结果显示，在细胞上清液中，与IL-1β组相比，Icariin组MMP-1、3、13的表达显著下降。1.3Icariin对IL-1β诱导的SW1353细胞的P-p38、P-JNK、P-ERK1/2以及β-catenin表达的影响与正常组相比，IL-1β诱导后P-p38、P-JNK、P-ERK1/2以及β-catenin表达明显增加；与IL-1β组相比，Icariin作用后，P-p38、P-JNK、P-ERK1/2以及β-catenin表达明显下降。1.4Icariin及通路抑制剂对MMP-1、3、13表达的影响与IL-1β组相比，SB203580组P-p38、MMP-1、MMP-3、MMP-13表达含量明显下降，PD98059组P-ERK1/2、MMP-1、MMP-3及MMP-13表达水平下降，SP600125组P-p46、P-p54及MMP-13表达下调，XAV-939组β-catenin及MMP-13表达下调，Icariin组MMP-1、MMP-3、MMP-13、P-p38、 P-ERK1/2、P-p46、P-p54及β-catenin表达明显降低。分别与各通路抑制剂组相比，Icariin组P-p38、P-p46、P-ERK1/2、 P-p46及β-catenin表达较高，而MMP-1、3、13表达水平较低。2.体内实验2.1Icariin及各通路抑制剂对大鼠膝OA软骨组织结构的影响正常组关节软骨表面光滑，各层细胞形状及排列整齐，潮线清晰。与正常组相比，模型组关节软骨Mankin·s评分升高，HE染色软骨层次破坏，软骨层变薄，软骨表层毛糙甚则溃疡形成。与模型组相比，其余各处理组软骨组织Mankin·s评分不同程度降低，软骨结构紊乱有明显改善，其中Icariin组Mankin·s评分降低最为显著，软骨结构破坏程度最轻。2.2Icariin及各通路抑制剂对大鼠膝OA软骨组织MMP-1、3、13表达的影响正常软骨组织中，MMP-1、3、13表达量较少；与正常组相比，模型组关节软骨组织MMP-1、3、13阳性表达增多，表达位置多位于软骨细胞胞质及细胞间质中。与模型组相比，SB203580组MMP-1、MMP-3、MMP-13阳性表达减少；PD98059组MMP-1、MMP-3及MMP-13阳性表达减少，SP600125与XAV-939组MMP-13表达减少。与通路抑制剂组相比，Icariin组MMP-1、3、13表达较少。2.3Icariin对大鼠膝OA软骨组织P-p38、P-JNK、P-ERK1/2及β-cateninIcariin组与正常组相比，P-p38、P-p46、P-ERK1/2及β-catenin表达升高；与模型组相比，P-p38、P-p46、P-p54、P-ERK1/2及β-catenin降低；分别与各通路抑制剂组相比，除P-p54外，P-p38、P-p46、P-ERK1/2及β-catenin表达较高。结论1.浓度为20μM的Icariin对细胞生长无影响，可作为最佳浓度。2. Icariin能下调IL-1β诱导的细胞MMP-1、3、13的表达。3. Icariin能抑制IL-1β诱导的细胞P-p38、P-ERK、P-JNK及β-catenin的高表达。除P-p54，Icariin对信号通路关键因子的抑制效力不及相应的信号通路抑制剂，但对MMP-1、3、13的抑制力优于各信号通路抑制剂。4. Icariin对Hulth法造模的大鼠膝OA模型的软骨组织Mankin·s评分及结构有明显的改善。5. Icariin能下调大鼠膝骨关节炎模型软骨组织MMP-1、MMP-3、MMP-13、P-p38、P-ERK1/2、P-JNK及β-catenin的蛋白表达水平。6. Icariin对p38、ERK、JNK及Wnt/β-catenin信号通路有一定程度的抑制作用。7. Icariin对MMPs的抑制强于单一的通路抑制剂，这可能跟Icariin参与多信号通路调控，通过多靶点效应抑制OA软骨MMPs表达有关。