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病毒性肺炎为一种急性的呼吸道病毒感染疾病,是流感病毒感染后最严重的并发症之一,为临床上的常见和多发的疾病,具有变化多和传变快等特点。除了发绀、持续高热和呼吸困难等症状外,还可能会导致呼吸窘迫综合征、休克甚至死亡。小檗碱是一类从中草药黄连等植物中提取分离到的异喹啉类生物碱,具有广泛的药理作用,尤其是其抗炎作用广受关注。我们的前期研究表明,小檗碱对小鼠流感病毒性肺炎具有治疗作用,对于流感病毒感染后肺部多种炎性物质的产生具有明显的抑制作用。且近年来,NLRP3炎性体在炎症反应中的作用成为研究热点。研究目的1、本研究在前期研究的基础上,以流感病毒PR8感染RAW264.7巨噬细胞为模型,以NLRP3炎性体为切入点,探究小檗碱抗流感病毒感染的分子机制,为诠释小檗碱抑制过度炎症反应治疗病毒性肺炎的分子机制提供理论和实验依据。2、为了进一步研究小檗碱对NLRP3炎性体作用的确切机制,构建NLRP3shRNA重组质粒和进行NLRP3基因克隆,分别为建立NLRP3基因沉默细胞模型和NLRP3过表达细胞模型奠定基础。研究方法本研究分为两部分:第一部分小檗碱对流感病毒感染巨噬细胞NLRP3炎性体的影响通过MTT法测定小檗碱对RAW264.7巨噬细胞的最大无毒浓度为6.25ug/mL;流感病毒PR8感染MDCK细胞,采用细胞病变效应检测TCID50为10-4.5/mL。以小鼠RAW264.7巨噬细胞为模型,将细胞分为正常组、病毒感染组和小檗碱干预组。病毒感染组以100TCID50流感病毒PR8作用细胞24小时,干预组在流感病毒感染的同时用小檗碱干预,继续培养24小时后收集细胞进行检测。1.通过Trizol法提取细胞RNA,用Real-timePCR检测小檗碱对流感病毒感染的巨噬细胞IL-1 β、IL-18和NF-κB mRNA表达的影响。2.用Real-timePCR检测小檗碱对流感病毒感染的巨噬细胞NLRP3炎性体关键分子mRNA表达的影响。3.提取细胞的蛋白,采用Caspase-1活性测定试剂盒检测小檗碱对流感病毒感染的巨噬细胞Caspase-1活性的影响。4.提取细胞的蛋白,采用Western Blot检测小檗碱对流感病毒感染后的巨噬细胞内NLRP3炎性体关键分子蛋白表达的影响。第二部分NLRP3基因克隆及其shRNA重组质粒的构建1.提取细胞RNA,进行反转录反应得cDNA。以此cDNA为模板,进行1st、2ndPCR扩增后,将PCR产物胶回收,与T载体连接。连接产物进行测序,测序成功即为NLRP3基因克隆成功。2.利用OligoEngine公司的shRNA设计软件,对小鼠靶基因NLRP3的siRNA序列进行了扫描,,并从候选siRNA序列中各挑选出4个靶点二级结构简单,特异性高,且GC值合理的siRNA序列,设计出方便表达载体构建插入的对应shRNA,并合成可以互补的寡核苷酸单链,两端分别引入HandⅢ和Xhol酶切位点,将可以互补的两条寡核苷酸链在PCR仪中退火,退火后形成带粘末端的双链DNA,连接到pGH1表达载体H1启动子的下游酶切位点,构建成可以稳定持续表达对应shRNA的表达载体,并对构建的4个shRNA表达载体分别进行测序鉴定,以保证构建的shRNA表达载体序列正确如设计。研究结果1、与正常组相比,病毒感染组炎性细胞因子IL-1 β、IL-18和转录因子NF-κB的mRNA表达都明显升高,分别是正常组的4.76倍、6.3倍和4.5倍;小檗碱干预组与病毒感染组相比,细胞因子IL-1 β、IL-18和NF-κB mRNA的表达量均有下降,分别为正常组的1.2倍、2.2倍和1倍。2、与正常组相比,病毒感染组NLRP3炎性体关键分子NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA的表达都明显升高,分别是正常组的2.9倍、2.86倍和2.55倍;小檗碱干预组与病毒感染组相比,NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA的表达量都有所下降,分别为正常组的0.55倍、1.5倍和0.39倍。表明小檗碱能够降低NLRP3、ASC和Caspase-1mRNA的表达。3、与正常组相比,病毒感染组Caspase-1酶活性增高,是正常组的2.23倍;小檗碱干预组是正常组的1.07倍,比病毒感染组明显降低,且差异有统计学意义。4、与正常组相比,病毒感染组Caspase-1蛋白表达增加;与病毒感染组相比,小檗碱干预组蛋白表达降低,且差异有统计学意义;NLRP3、ASC、IL-1 β蛋白表达量,与正常组相比,病毒感染组都增加,且差异具有统计学意义;与病毒感染组相比小檗碱干预组都下降,但差异没有统计学意义。5、NLRP3基因克隆成功。6、NLRP3 shRNA重组质粒的构建成功。研究结论与意义以上研究结果提示,巨噬细胞感染流感病毒后NLRP3炎性体形成,导致Caspase-1活化,产生大量的IL-1 β和IL-18。小檗碱可能通过干预NLRP3炎性体形成、抑制Caspase-1活化,从而减少流感病毒感染的巨噬细胞产生炎症因子IL-1 β和IL-18。本研究为阐明小檗碱抗流感病毒感染的作用机制提供了一定的理论和实验依据。本研究还成功克隆了 NLRP3基因并成功构建了 NLRP3的shRNA重组质粒,为建立NLRP3过表达细胞模型和NLRP3基因沉默细胞模型,进一步研究流感病毒及小檗碱对NLRP3炎性体的作用奠定了基础。