研究背景与意义:胰腺癌是目前早期最难发现、疗效最差、死亡率最高的恶性肿瘤之一,全世界每年约有30万人死于胰腺癌,5年存活率低于6%,仅有不到20%的胰腺癌患者可接受手术治疗[1]。早期发现困难、易复发与转移、高度耐药是其预后极差的主要原因[2]。目前,胰腺癌治疗方法主要包括根治性手术切除、新辅助化疗（如:FOLFIRINOX和nab-paclitaxel-gemcitabine）、放疗等[3-8]。尽管经过广大科研和临床工作者的不懈努力,胰腺癌的诊断、治疗取得了长足的进步,但患者预后仍不理想[9-11]。目前开展的各项临床和基础科学研究主要侧重于研究如何有效地靶向调控编码癌基因蛋白的基因（例如:KRAS,Myc,PI3K/AKT/mTOR）,却未能研发出具有临床应用价值的抑制剂[12-14]。因此,当前迫切需要进一步深入探讨胰腺癌的生物学特性及其相关分子机制,开发新的具有临床应用价值的早期诊断标志物及治疗策略。越来越多的证据表明,表观遗传学的调控（甲基化、非编码RNA）是导致肿瘤细胞耐药的主要分子机制之一。微小RNA（miRNA）是一类长度约为18-22核苷酸的小非编码RNA,通过与靶点mRNA的3’非翻译区结合,导致翻译抑制或mRNA降解,从而在后转录调控中发挥着重要的功能和作用[15-17]。既往研究提示:miRNA表达失调与肿瘤增殖、凋亡、侵袭、转移、耐药等密切相关[18,19]。最近研究显示:多个miRNAs作为肿瘤抑制子或致癌基因参与调控胰腺癌的发生与进展,可调控多个关键靶点和信号通路（如:KRAS,TP53,PI3K/AKT,NF-κB and Hedgehog信号通路等）[20-24]。Calin研究团队首次报道了miR-15a和miR-16同时缺失是导致慢性淋巴细胞白血病的主要病因[25]。同时,其他研究团队的研究结果揭示:在胃癌、结肠癌、胰腺癌中,miR-15a作为抑癌基因可通过调控多个重要靶点（如:BMI-1,BCL-2,YAP-1,DCLK-1等）,影响肿瘤的发生发展[21,22,26,27]。随着研究的深入,作为抑癌基因miR-15a在胰腺癌中的抑癌作用逐步突显。然而,miR-15a如何参与调控胰腺癌的进展、是否有可能通过修饰miR-15a以增强其在胰腺癌中的抑癌作用等,尚有待进一步探究。基于此,我们将目光聚焦在运用于胰腺癌的化疗药物。作为传统化疗药物,5-氟尿嘧啶（5-FU）是尿嘧啶的类似物,由氟原子在C-5位置代替氢而形成。5-FU代谢产物FdUMP与胸苷酸合成酶（TS）和Ch2THF形成自杀式三元复合物,从而阻断正常底物dUMP的结合并抑制dTMP合成,导致DNA损伤。目前,5-FU是治疗胰腺癌以及其他实体肿瘤的基础性化疗药物,广泛应用于临床已有几十年历史,其主要通过杀伤快速增殖的癌细胞发挥作用,从而延长患者的生存时间[28,29]。然而,5-FU易形成耐药,失去对胰腺癌细胞增殖的抑制作用,患者易出现早期复发与转移,最终导致治疗失败。研究揭示:在miR-15a引导链上存在多个尿嘧啶碱基,使用5-FU可将miR-15a引导链上的所有尿嘧啶碱基全部替换[26,30]。那么,是否有可能将miR-15a与5-FU合成为一化学复合物并运用于胰腺癌的研究中呢?该复合物是否兼具miR-15a的抑癌作用和5-FU杀伤癌细胞的治疗效果呢?基于该研究思路,我们尝试将miR-15a与5-FU进行化学合成,通过实验研究进一步探索该化学复合物在胰腺癌中的功能及其相关分子机制。研究目的:研究miR-15a在胰腺癌组织中的表达、功能和作用以及临床意义;探讨新合成复合物5-FU-miR-15a在胰腺癌中的功能、分子机制、治疗潜能等,为开发新的胰腺癌诊治策略提供新思路。研究方法:1.首先采用real-time qRT-PCR测定miR-15a和miR-16在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达情况;下载、整理TCGA数据,统计分析miR-15a表达量与胰腺癌患者预后生存时间的相关性;采用real-time qRT-PCR、细胞核质分离技术、western blotting等方法探索胰腺癌中miR-15a和miR-16出现差异性表达的原因;采用细胞转染技术、WST-1细胞增殖测定、流式细胞术、western blotting等方法研究miR-15a对胰腺癌细胞增殖、细胞周期进程的影响以及相关重要靶点（p27、cyclin A表达情况）。2.构建5-FU-miR-15a复合物:采用细胞转染技术、WST-1细胞增殖测定、流式细胞术研究5-FU-miR-15a对胰腺癌细胞增殖、细胞周期进程的影响;采用细胞周期PCR、TargetScan&miRDB靶点预测软件、western blotting、荧光素酶报告基因、real-time qRT-PCR等鉴定并验证5-FU-miR-15a在胰腺癌中的特异性靶点及其表达情况。3.采用免疫组化检测Wee1下游靶点CDC2在胰腺癌组织中的表达情况:下载、整理TCGA数据,统计分析CDC2表达量与胰腺癌患者预后生存时间的相关性;采用DNA损伤诱导实验、western blotting、real-time qRT-PCR等方法证明miR-15a可调控Wee1/Chk1/CDC2信号通路的活性。4.采用细胞转染技术、细胞毒性实验、药物协同作用实验等评估分析5-FU-miR-15a与吉西他滨是否可以发生协同效应、是否可提高胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性。5.构建胰腺癌转移性肿瘤动物模型:采用动物实验的方法证明5-FU-miR-15a可抑制胰腺癌转移性肿瘤的形成,克服化疗耐药,提高胰腺癌化疗药物吉西他滨的治疗效果,改善预后。6.采用基因芯片筛选技术和生物信息学分析方法,测定环状RNA在胰腺癌中的表达谱和鉴定具有明显表达差异性的环状RNA;采用real-time PCR、生物信息学分析方法鉴定环状RNA与miR-15a或miR-506互补结合位点以及分析二者表达相关性。研究结果:1.与正常胰腺组织相比,miR-15a明显低表达于胰腺癌组织中（P=0.0014）,但miR-16表达未见明显差异（P=0.4118）;miR-15a表达量高的胰腺癌患者生存时间明显高于miR-15a表达量低的胰腺癌患者（P<0.0001）。2.miR-15a和miR-16作为共同聚集于染色体13q14且有着相同初级转录子的抑癌基因,常同时缺失于多种癌症中,但miR-16在胰腺癌组织和正常胰腺组织中表达未见明显差异（P>0.05）,而miR-15a明显低表达于胰腺癌组织中（P<0.0001）,二者在胰腺癌中出现明显的差异性表达,其原因为:miR-15a表达的明显减少发生在从precursor miR-15a到加工形成mature miR-15a的阶段（P<0.05）,而mature miR-16表达水平则与pre-miR-16相似,未见显著性差异（P>0.05）。3.miR-15a明显抑制胰腺癌细胞增殖,触发胰腺癌细胞周期G1期停滞,G2期明显减少,可调控与细胞周期G1期停滞有关的重要靶点（即:p27、cyclin A）。（P<0.05）4.成功构建5-FU-miR-15a,提高了对胰腺癌细胞增殖的抑制作用,影响胰腺癌细胞周期进程（即:S期增加,G2期明显减少）;5-FU-miR-15a可调控下游特异性靶点Wee1和Chk1表达,同时也保留了对miR-15a靶点BMI-1和Yap-1的特异性。（P<0.05）5.Wee1下游重要靶点CDC2明显过度表达于胰腺癌组织中,CDC2高表达的胰腺癌患者生存时间明显低于CDC2低表达的胰腺癌患者,miR-15a可明显下调CDC2表达;miR-15a可抑制Wee1/Chk1/CDC2信号通路的激活。（P<0.05）6.5-FU-miR-15a可与吉西他滨产生协同效应,增加胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性;5-FU-miR-15a明显抑制胰腺癌转移性肿瘤的生长,克服化疗耐药,提高胰腺癌化疗药物吉西他滨的治疗效果,改善预后。（P<0.05）7.多个具有明显表达差异性的环状RNA异常表达于胰腺癌组织中;多个环状RNA与miR-15a或miR-506具有多个互补结合位点,环状RNA可通过“海绵效应”吸附miR-15a或miR-506发挥功能作用,二者具有明显的相关性。（P<0.05）结论:1.miR-15a低表达于胰腺癌组织和细胞,其表达量与胰腺癌患者预后生存时间密切相关。2.miR-15a和miR-16差异性表达于胰腺癌中,原因为:miR-15a表达明显减少发生在从precursor miR-15a加工形成mature miR-15a的阶段。3.作为抑癌基因miR-15a抑制胰腺癌细胞增殖,阻滞细胞周期。4.体内外功能实验表明,新合成化合物5-FU-miR-15a抑制胰腺癌细胞增殖和转移性肿瘤的生长,影响细胞周期进程,增加胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性,克服化疗耐药,负性调控Wee1、Chk1、BMI-1、Yap-1,保留了miR-15a的靶点特异性。5.CDC2过度表达于胰腺癌中,其表达量与胰腺癌患者预后密切相关;miR-15a通过负性调控Wee1、Chk1、CDC2,抑制Wee1/Chk1/CDC2信号通路的激活。6.多个环状RNA异常表达于胰腺癌中且与miR-15a或miR-506具有多个互补结合位点,多个环状RNA可通过“海绵效应”吸附miR-15a或miR-506发挥功能作用。