心源性猝死(sudden cardiac death，SCD)系指由于心脏原因所致的突然、意外的自然死亡，占成人猝死原因的首位。在引发SCD的原因中，急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）是最主要的原因，由于短暂的（冠状动脉痉挛）或持续的（冠状动脉闭塞）的急性心肌缺血后，冠状动脉血流量降低，心肌氧等物质供应不足，代谢产物清除减少，引起心脏电生理活动紊乱和/或心肌机械收缩功能障碍，导致大多数病人常在发病后6小时内死亡，甚至1h内死亡。心肌缺血后至少需要6小时在HE染色下才会出现光镜的形态学改变（如凝固性坏死、多灶性心肌纤维波浪样变、核固缩、收缩带坏死、炎细胞浸润等）。而在法医学实践中，早期心肌缺血（early myocardial ischemia, EMI）猝死者多在心肌缺血发生后6小时内死亡，死后常规检查除可见冠状动脉及其分支存在不同程度的动脉粥样硬化外，由缺血性损伤因素所致的病理形态学改变极难检出，使早期心肌缺血的死后诊断成为法医病理学鉴定的难点。多年来国内外学者都在寻找敏感、稳定、实用的诊断早期心肌缺血的方法和指标，从常规HE染色、特殊染色和酶组织化学、免疫组织化学、超微结构、荧光检查、离子含量改变、心包液和血液心肌损伤标志物检测、死后影像学检查等方面进行了积极的探索，所有这些方法都从不同方面、不同程度地丰富了EMI死后诊断的内容。但是上述方法或因为操作过于复杂，或实用性不强，或因为缺乏特异性、费用过高等因素的影响而限制了它们在法医病理学中的应用，实际应用价值各家说法不一，迄今仍没有敏感、实用的方法或指标能很好解决实际办案中的死因诊断问题。在众多研究方法中，免疫组织化学因其具有特异性强、敏感性高、实用性好等优点，已应用到EMI的研究和应用中来。近年来，许多学者陆续报道了如肌动蛋白（actin）、肌钙蛋白、心型脂肪酸结合蛋白（heart typefatty acid binding protein, H-FABP）、抗肌萎缩蛋白等蛋白分子在急性心肌缺血时从心肌细胞内脱失的现象；血浆中某些蛋白成分如补体成分、纤维连接蛋白（fibronectin, Fn）等在缺血心肌的异常分布情况；缺血心肌诱导表达某些敏感蛋白分子，如缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1alpha, HIF-1α）、血管内皮生长因子等。这些研究从多角度观察了急性心肌缺血时心肌细胞发生的各种变化，部分指标在EMI心脏标本进行了验证，但考虑到缺血心肌自身演变的特点和法医学实践中案例的复杂性和特殊性，单一方法和单一检测指标的应用缺乏说服力而难以有效发挥其诊断价值，而以往这些研究为多指标联合应用提供了理论依据。同时，考虑到法医检案的特殊性，如EMI发病时间、尸体保存情况、固定时间等因素的影响，需针对不同的情况进行检测指标的组合，以期达到最好的诊断效果。据此，本课题以大鼠急性心肌缺血模型和法医检案心脏标本作为研究对象，研究：①对比观察铁钒-苏木素-伊红染色法（Heidenhain染色）、变色酸2R-亮绿染色和苏木素-碱性复红-苦味酸染色（HBFP染色）对缺血心肌的染色能力，观察不同保存条件及10%福尔马林固定时间对染色的影响；②从不同角度选取检测指标：心肌结构蛋白或胞浆蛋白：actin(HHF35)、H-FABP、S100A1；黏附和进入心肌细胞内的血浆成分：C5b-9、Fn；缺血心肌诱导表达的产物：聚集素蛋白（clusterin，CLU）、HIF-1α、HIF-2α、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type1motifs，ADAMTS-1），观察大鼠急性心肌缺血后血浆S100A1含量的变化及9个诊断指标在大鼠急性缺血心肌中的表达变化情况；③观察不同保存条件及10%福尔马林固定时间对上述9个免疫组织化学检测指标染色的影响；④以法医病理检案心脏标本进行印证，观察检测指标表达情况、阳性率及特异性，为EMI猝死案例的法医病理学诊断提供客观依据。第一部分三种组织化学特殊染色在早期心肌缺血死后诊断中的应用和比较目的：对比观察Heidenhain染色、变色酸2R-亮绿染色和HBFP染色对急性缺血心肌的染色能力，观察不同保存条件及10%福尔马林固定时间对染色结果的影响。方法：采用结扎大鼠左冠状动脉前降支的方法建立AMI模型，实验动物190只，雌雄不拘，体重250~300g，随机分为正常对照组（5只）、假手术组（5只）、心肌缺血组（根据缺血时间不同分为急性心肌缺血15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h组共8个亚组，每组5只）、-20℃保存组、4℃保存组、室温保存组（大鼠急性心肌缺血6h心脏标本根据在三个保存条件下保存时间不同又分为保存1d、3d、5d、7d、14d、21d、28d组共7个亚组，每组5只）和固定时间组（大鼠急性心肌缺血6h心脏标本根据10%福尔马林固定时间不同又分为固定3d、5d、7d、14d、21d、28d、42d组共7个亚组，每组5只）。建立Heidenhain染色、变色酸2R-亮绿染色及HBFP染色三种组织化学特殊染色方法观察各组染色结果。结果：1大鼠急性心肌缺血15min，Heidenhain染色、变色酸2R-亮绿染色及HBFP染色均可在缺血区左心室心内膜下及乳头肌处见小灶状心肌细胞阳性着色，随缺血时间延长，阳性着色面积进一步扩大，三种组织化学特殊染色阳性着色部位一致。2缺血心脏标本-20℃、4℃和室温保存过程中，随保存时间的延长，三种组织化学特殊染色均出现染色能力下降，阳性面积缩小的趋势，-20℃和4℃保存28d、室温保存21d后，Heidenhain染色效果优于另两种组织化学特殊染色，尤其显示收缩带坏死效果突出。3缺血心脏标本10%福尔马林固定42d后，Heidenhain染色效果好于另两种组织化学特殊染色，大片状缺血心肌细胞成阳性着色，与周边非缺血区边界清晰。小结：Heidenhain染色较变色酸2R-亮绿染色和HBFP染色可操作性强、敏感性高、死后变化及长时间固定影响小，可作为法医学实践中EMI死后诊断首选的组织化学特殊染色方法。第二部分大鼠急性心肌缺血多指标免疫组织化学检测目的：观察大鼠急性心肌缺血后不同时间点血浆S100A1含量变化及心肌细胞内actin(HHF35)、H-FABP、S100A1、C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-1的表达敏感性及变化规律。方法：1采用ELISA法检测大鼠急性心肌缺血后不同时间点血浆S100A1含量。2采用Western blot检测大鼠急性心肌缺血后不同时间点缺血心肌ADAMTS-1蛋白的表达3采用免疫组织化学方法观察大鼠急性缺血后不同时间点心肌细胞内actin(HHF35)、H-FABP、S100A1、C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-1的表达敏感性及变化规律。结果：1大鼠急性心肌缺血15min后血浆S100A1含量与假手术组相比明显升高（P<0.05），且随着缺血时间的延长，血浆S100A1含量逐渐升高，至缺血6h时达到高峰。2大鼠急性心肌缺血15min后缺血区心肌细胞内ADAMTS-1蛋白表达与假手术组相比明显升高（P<0.05），且随着缺血时间的延长，ADAMTS-1蛋白的表达逐步升高，至缺血6h时达到高峰。3大鼠急性心肌缺血后不同时间点免疫组织化学结果①actin(HHF35)、H-FABP、S100A1：对照组心肌细胞呈现较均匀一致的棕黄色阳性染色，急性心肌缺血15min后actin(HHF35)、H-FABP和S100A1三种蛋白在缺血区左心室心内膜下及乳头肌可见小灶性心肌细胞胞浆缺染，随缺血时间的延长，缺染范围逐渐扩大，自心内膜向心外膜发展，缺血4h三种蛋白缺染扩展至近心肌全层，与周边非缺血区阳性着色的心肌细胞界限清晰。在各缺血组三种蛋白缺染位置基本一致。②ADAMTS-1、CLU：对照组心肌细胞阴性表达，急性心肌缺血15min缺血区心内膜浅层及乳头肌散在心肌细胞出现阳性表达，随着缺血时间的延长，阳性范围逐渐扩大，缺血4h缺血区心肌细胞片状阳性表达，阳性着色扩展至近心外膜，CLU缺血4h时表达达高峰，ADAMTS-1缺血6h时表达达高峰③C5b-9、HIF-1α：对照组及急性心肌缺血15min组心肌细胞呈阴性表达，缺血30min时在缺血区心内膜浅层及乳头肌散在心肌细胞出现阳性表达，随着缺血时间的延长，阳性范围逐渐扩大，缺血4h缺血区心肌细胞片状阳性表达，阳性着色扩展至近心外膜，缺血6h时表达达高峰。④HIF-2α：对照组、急性心肌缺血15min和30min组心肌细胞呈阴性表达，缺血1h后，缺血区心内膜浅层及乳头肌散在心肌细胞出现阳性表达，随着缺血时间的延长，阳性范围逐渐扩大，缺血5h缺血区大部分心肌细胞表达阳性，阳性着色扩展至近心外膜，表达达高峰。⑤Fn：对照组、急性心肌缺血15min和30min组心肌细胞呈阴性着色，缺血1h缺血区心内膜下浅层及乳头肌毛细血管腔内血浆出现阳性反应，缺血2h后缺血区心内膜下浅层及乳头肌心肌细胞出现Fn阳性着色，血管腔内血浆及血管壁阳性着色，随着缺血时间的延长，阳性着色范围逐渐扩大，缺血6h达到高峰。小结：大鼠急性心肌缺血15min actin(HHF35)、H-FABP和S100A1即可出现缺失，ADAMTS-1和CLU蛋白出现阳性表达；C5b-9和HIF-1α在大鼠急性心肌缺血30min出现阳性表达；HIF-2α在大鼠急性心肌缺血1h出现阳性表达；Fn在大鼠急性心肌缺血2h出现阳性着色。随缺血时间的延长，actin(HHF35)、H-FABP和S100A1蛋白染色缺失愈加明显，而C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-1蛋白则阳性着色逐渐增强。第三部分不同保存条件及10%福尔马林固定时间对急性心肌缺血免疫组织化学诊断指标的影响目的：观察三种保存条件：-20℃、4℃和室温及10%福尔马林固定时间对第二部分观察的9个免疫组织化学诊断指标染色的影响。方法：采用免疫组织化学方法观察不同保存条件及10%福尔马林固定时间对急性缺血心肌细胞内actin(HHF35)、H-FABP、S100A1、C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-1表达变化的影响。结果：1不同保存条件对免疫组织化学诊断指标染色的影响：①室温保存对目的蛋白免疫组织化学染色的影响最大，4℃保存其次，-20℃保存影响最轻。②大鼠急性心肌缺血心脏标本在-20℃、4℃及室温条件下保存，actin(HHF35)、H-FABP及S100A1抗原稳定性最差，只限于对-20℃和室温保存1天、4℃保存3天标本有诊断意义。③C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α、ADAMTS-1均显示出良好的抗原稳定性，其中CLU稳定性最好，可适用于三个保存条件下28d以内心脏标本的检测；C5b-9相对稳定性最差，适用于-20℃保存28d、4℃保存21d、室温保存14d以内标本，且保存不同时间后，非缺血区心肌细胞均未见出现假阳性干扰结果判断。210%福尔马林固定时间对免疫组织化学诊断指标染色的影响：随固定时间的延长，各指标免疫组织化学阳性染色强度有下降的趋势，尤以缺血区中央明显，固定42d时，各候选指标免疫组织化学阳性染色仍清晰可辨，缺血区与非缺血区免疫组织化学染色分界清晰。小结：actin(HHF35)、H-FABP及S100A1抗原稳定性最差，只限于对-20℃和室温保存1天、4℃保存3天标本有诊断意义。C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α、ADAMTS-1均显示出良好的抗原稳定性，其中CLU稳定性最好，可适用于三个保存条件下28d以内心脏标本的检测；C5b-9相对稳定性最差，适用于-20℃保存28d、4℃保存21d、室温保存14d以内标本。9个诊断指标均可用于10%福尔马林固定42d以内的心脏组织标本的检测。第四部分免疫组织化学诊断指标在人体尸检心脏标本的检测目的：将9个免疫组织化学诊断指标在法医病理检案心脏标本上进行印证，观察检测指标的诊断价值、阳性率及特异性。方法：实验分为正常对照组（10例）、明确心肌梗死组（10例）、疑似心肌梗死组（10例）、其他案例组（23例，包括机械性窒息、电击死、失血性休克、一氧化碳中毒、病毒性心肌炎），采用免疫组织化学方法观察各组心脏标本actin(HHF35)、H-FABP、S100A1、C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-1的表达情况。结果：1正常对照组心肌细胞actin(HHF35)、H-FABP和S100A1呈现较为均匀一致阳性表达，而明确心肌梗死组、疑似心肌梗死组和其他案例组均可见actin(HHF35)、H-FABP和S100A1呈片状或弥漫性、灶状染色缺失。明确心肌梗死组、疑似心肌梗死组和其他案例组actin(HHF35)、H-FABP和S100A1缺染阳性率高于正常对照组，但三组之间无明显差异。2正常对照组和失血性休克案例心肌细胞内C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-1均呈阴性表达，明确心肌梗死组和大部分疑似心肌梗死组案例心肌细胞可见C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α、ADAMTS-1阳性表达。而机械性窒息部分案例可见HIF-1α和HIF-2α阳性表达，电击死部分案例可见Fn阳性表达，一氧化碳中毒部分案例可见C5b-9、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-1阳性表达，病毒性心肌炎案例可见C5b-9、Fn、CLU和ADAMTS-1阳性表达。明确心肌梗死组和疑似心肌梗死组6个诊断指标的阳性率明显高于正常对照组和其他案例组。小结：actin(HHF35)、H-FABP、S100A1、C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-1共9个诊断指标在急性心肌梗死人体心脏标本上得到了印证，其中actin(HHF35)、H-FABP和S100A1诊断特异性最差，不宜单独使用进行EMI的死后诊断，C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-1诊断价值良好，但在其他非梗死性的直接或间接引起心肌损害的案例，如机械性窒息、电击死、一氧化碳中毒、心肌炎等中也有表达，将多个诊断指标联合应用将提高EMI死后诊断正确率。结论：本研究从法医病理学实用角度出发，采用大鼠急性心肌缺血模型和人体尸检心脏标本作为研究对象，系统地观察了三种组织化学特殊染色和9个免疫组织化学诊断指标在急性心肌缺血6小时内死后诊断的敏感性、实用性和特异性，得出以下结论：1Heidenhain染色较变色酸2R-亮绿染色和HBFP染色可操作性强、敏感性高、死后变化及10%福尔马林固定时间影响小，可作为法医学实践中早期心肌梗死死后诊断首选的组织化学特殊染色方法。2大鼠急性心肌缺血15min actin(HHF35)、H-FABP和S100A1即可出现缺失，ADAMTS-1和CLU蛋白出现阳性表达；C5b-9和HIF-1α在大鼠急性心肌缺血30min出现阳性表达；HIF-2α在大鼠急性心肌缺血1h出现阳性表达；Fn在大鼠急性心肌缺血2h出现阳性着色。随缺血时间的延长，actin(HHF35)、H-FABP和S100A1蛋白染色缺失愈加明显，而C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-1蛋白则阳性着色逐渐增强。3actin(HHF35)、H-FABP及S100A1稳定性最差，只限于对-20℃和室温保存1天、4℃保存3天标本有诊断意义。C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α、ADAMTS-1均显示出良好的稳定性，其中CLU稳定性最好，可适用于三个保存条件下28d以内心脏标本的检测；C5b-9相对稳定性最差，适用于-20℃保存28d、4℃保存21d、室温保存14d以内标本。9个诊断指标可用于10%福尔马林固定42d以内的心脏组织标本的检测。4actin(HHF35)、H-FABP、S100A1、C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-19个诊断指标在EMI人体心脏标本上得到了印证，其中actin(HHF35)、H-FABP和S100A1诊断特异性最差，不宜单独使用进行EMI的死后诊断，C5b-9、Fn、CLU、HIF-1α、HIF-2α和ADAMTS-1特异性强、敏感性高，诊断价值良好，但在其他非梗死性的直接或间接引起心肌损害的案例中也有表达，将多个诊断指标联合应用将提高EMI死后诊断正确率。综上，本研究阐明了组织化学特殊染色和9个免疫组化诊断指标在心肌缺血的染色变化规律、影响因素、相互关系和应用条件，为早期心肌梗死死后诊断确立了较完善的病理形态学指标系统。