植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)是临床上常用的一项辅助生殖技术，近20年来已在世界各地广泛应用。该技术通过体外培养胚胎至4-8细胞阶段抽取1-2个卵裂球(balstomere biopsy)进行分子生物学分析，筛选合适的胚胎植入母体子宫，分娩出健康的婴儿。卵裂球活检作为整个诊断过程的重要组成部分，对胚胎存在着潜在的安全隐患。然而这项技术从诞生至今，没有对其进行系统全面的安全性评估，对通过该技术出生的子代也缺乏长期健康状况监测的数据。本实验室为了评估卵裂球活检对出生后子代的风险，以经过卵裂球活检后出生的小鼠作为实验组（BIOPSY组），以胚胎体外培养至4细胞阶段不经过活检而直接植入母体子宫后出生小鼠为对照组（IVEM组）。前期研究我们通过水迷宫实验发现卵裂球活检后出生的小鼠成年以后学习记忆能力显著下降，并提示老年阶段发生神经退行性病变的潜在高风险。活检后出生小鼠是否在老年阶段有罹患类神经退行性疾病的风险尚不明确；出生后子代神经系统异常的分子机制尚不清楚。在本课题研究中，为了评估卵裂球活检出生后子代老年阶段是否有罹患类神经退行性疾病的风险，我们选择老年阶段的小鼠模型开展以下研究。首先，通过电子显微镜观察发现实验组小鼠脑组织海马区域存在严重的线粒体变性，脂褐素沉积和脱髓鞘的病理改变。Western Blot和免疫组织化学结果提示实验组小鼠脑组织内的髓鞘相关蛋白myelin basic protein (MBP)表达显著下降。为了进一步确证老年小鼠脑组织发生的病理改变，寻找相关的作用蛋白，我们通过二维电泳结合质谱鉴定的技术方法对脑组织进行蛋白质组学分析；生物信息学分析提示实验组小鼠存在类神经退行性疾病的罹患风险，差异蛋白验证结果也证实一些退行性疾病相关的分子指标如superoxide dismutase1(SOD1)，neurofilament (NEFL)， dihydropyrimidinase-like2(DPYSL2)， aldehydedehydrogenase2(ALDH2)，其表达趋势与蛋白质组学研究结果一致。近年来许多研究提示辅助生殖技术会影响DNA甲基化。为了研究卵裂球活检是否会影响脑组织DNA甲基化,我们通过免疫沉淀甲基化的DNA片段结合芯片技术来寻找可能的发病机制，结果显示实验组小鼠的神经系统异常与表观遗传水平的改变有关。对chromodomain helicase DNAbinding protein4(CHD4)启动子区的差异甲基化区进行亚硫酸氢盐修饰后测序，结果提示实验组小鼠该基因启动子区呈现相对低甲基化；实时定量PCR结果也证实实验组小鼠chd4基因表达升高。Western Blot结果显示，受抑制性转录因子chd4调控的髓鞘相关蛋白myelin proteolipid protein1(PLP)在部分实验组小鼠中表达下降。上述结果提示chd4启动子区的低甲基化可以使chd4基因表达上调，从而抑制PLP蛋白的表达，发生脱髓鞘的病变。除此以外还存在其他导致类退行性病变的作用机制。为了研究实验组小鼠脑组织是否是由于卵裂球活检操作而在出生前就形成整体水平的低甲基化状态，我们选择早期胚胎甲基化重建已经完成的E7.5天，对早期胚胎的整体甲基化水平进行了分析。结果显示实验组呈现整体水平的相对低甲基化状态，提示早期胚胎发育过程中甲基化重建发生了障碍。为了研究早期胚胎甲基化重建发生障碍的机制，我们通过表达谱芯片对卵裂球活检后的囊胚的转录本进行整体水平的分析，结果显示在183条差异基因中，有58条基因（31.7%）参与DNA甲基化、染色质重塑、细胞周期、氧化应激、细胞分化和胚胎发育等生物学事件。实时定量PCR结果证实euchromatichistone-lysine N-methyltransferase2(ehmt2)，cullin3(cul3)，nuclear receptorcorepressor2(ncor2)， phosphoglycerate dehydrogenase (phgdh)这些关系甲基化重建和细胞分化的基因在卵裂球活检后的囊胚表达显著下降。上述结果提示卵裂球活检后出生个体组织器官的低甲基化状态，可能是由于囊胚阶段参与甲基化重建的因子表达下调而导致的。总之，本研究的结果提示经卵裂球活检出生的子代有罹患类神经退行性疾病的风险，这种神经系统的异常可能与早期胚胎中某些甲基化重建因子表达降低，从而导致子代表观遗传水平改变有关。在临床大规模应用之前，对于该技术对子代存在的潜在影响还需要大规模的流行病学调查研究；操作本身对子代的风险还需要更进一步在整体水平，系统全面的进行评估。同时进一步改进、完善临床现有的技术方法，将出生缺陷风险降至最低。