精原干细胞（Spermatogonia stem cell），也称雄性生殖干细胞。是位于雄性动物睾丸曲细精管基底处的一类细胞，它是雄性动物体内源源不断生产精子的基础。其除了具有一般干细胞所共同拥有的自我更新能力与多向分化潜能的特征外，它还是体内唯一一种可以将遗传物质传递给后代个体的成体干细胞。精原干细胞为人类研究精子发生过程的机制提供了良好的平台，为动物不育症的研究和治疗提供了基础，对于生殖医学和畜牧兽医学发展具有重要的意义。目前，对于精原干细胞自我更新和分化的机制有了一些初步研究，但是机理研究还尚未深入涉及。尤其是在大型家畜上，对于精原干细胞自我更新的机制研究还较少。Ras/Raf/MAP2K/MAPK信号通路在体内细胞中分布广泛，对细胞的增殖、分化等具有重要作用，但是该信号通路在奶山羊精原干细胞自我更新中的作用研究还未见报道。本研究以奶山羊为研究对象，首先对分离得到的奶山羊精原干细胞，通过PCR、碱性磷酸酶染色与免疫荧光染色、体外诱导分化等手段确认其为精原干细胞。进一步采用MEK特异性抑制剂阻断奶山羊精原干细胞的Ras/Raf/MAP2K/MAPK通路，通过碱性磷酸酶染色、细胞计数、生长曲线、BrdU阳性率、凋亡率与细胞周期检测等，探讨Ras/Raf/MAP2K/MAPK通路对奶山羊SSCs自我更新的作用，发现Ras/Raf/MAP2K/MAPK通路可能是通过介导其下游Etv5和Bcl6b来发挥作用的。本实验初步研究了Ras/Raf/MAP2K/MAPK通路在奶山羊精原干细胞自我更新方面的作用，为深入了解雄性动物精原干细胞自我更新机制奠定了基础。1．奶山羊精原干细胞的分离培养与鉴定采用胶原酶、DNase与分解酶联合初次消化剪碎的奶山羊睾丸组织，用胰蛋白酶和DNase二次消化上一步所得细胞，获得了足够数量且成活率较高的精原干细胞。采用培养皿铺纤维连接蛋白差速的方法，获得了纯度较高的奶山羊精原干细胞；对分离得到的细胞进行PCR、碱性磷酸酶染色与免疫荧光染色鉴定，表明分离得到的细胞能够表达一些奶山羊精原干细胞的特异性标记。在获得的奶山羊精原干细胞中超表达促进减数分裂的基因-Dazl，在体外对奶山羊精原干细胞进行诱导分化。结果表明分离得到的细胞能够被诱导起始减数分裂。从而验证了其在体外具有向雄性生殖细胞分化的能力。2.奶山羊精原干细胞Ras/Raf/MAP2K/MAPK信号通路对其自我更新影响的研究首先，采用不同浓度的MAP2K/MEK1/2特异性抑制剂-PD0325901对奶山羊精原干细胞进行培养，然后对碱性磷酸酶阳性细胞比例、细胞数量、生长曲线、BrdU阳性率进行检测，发现阻断Ras/Raf/MAP2K/MAPK信号通路能够影响奶山羊精原干细胞的自我更新。细胞周期检测发现，阻断该通路导致细胞停滞在G1期，从而影响了奶山羊精原干细胞的增殖。对细胞进行凋亡检测发现，阻断Ras/Raf/MAP2K/MAPK通路引起细胞凋亡增加。结合Western Blotting检测，确认PD0325901能够阻断Ras/Raf/MAP2K/MAPK信号通路，并确定了PD0325901完全阻断该通路的适宜浓度。最后，检测了两个Ras/Raf/MAP2K/MAPK信号通路下游的转录因子Etv5与Bcl6b，发现这2种转录因子蛋白表达量减少。因此，我们推测阻断Ras/Raf/MAP2K/MAPK信号通路导致奶山羊精原干细胞自我更新受到抑制，可能是由于Etv5与Bcl6b这两个与精原干细胞自我更新密切相关的转录因子的表达下调而引起的。