合成生物学不同于传统生物学的研究方向,是利用已存在的标准生物学元件创造新奇和有功能的模块、系统和有机体的一门新兴工程性学科。迄今为止,哺乳动物细胞合成生物学已经实现多种刺激因子调控的基因环路及其组建的复杂基因网络在哺乳动物细胞中运行并藉此展现其在未来生物医疗上的巨大潜力。小分子化学物质调控基因环路是最早设计并上载到哺乳动物细胞中的人造生物系统,这些化学物质包括抗生素(如四环素、红霉素),食品添加剂(如苯甲酸,香草酸)以及化妆品内容物(如根皮素,对羟苯甲酸酯)等。然而,上述小分子化合物在人体服用后存在较大安全问题,因此急需开发更加安全、高效的小分子化合物调控系统。本研究首先进行酚酸类似物的筛选,发现阿魏酸在自然界中广泛存在并且是很多中草药材中的有效成分。同时,阿魏酸具有将padA基因转录调节子PadR蛋白从特定的操纵子序列上解离下来的能力。因此,我们设计阿魏酸转录调控的关闭系统(OFF Switch)和开启系统(ON Switch)。OFF Switch的工作原理是阿魏酸(钠)可以将转录激活结构域VP16或VP64与PadR的融合蛋白(aPadR,转录激活子)从特定操纵子序列(OpadR)解离下来而关闭下游报告基因的表达。ON Switch的运行机制相反,阿魏酸(钠)可以使转录抑制结构域KRAB与PadR的融合蛋白(iPadR,转录抑制子)从特定的操纵子序列(OpadR)上解离而开启下游基因的转录表达。OFF Switch和ON Switch设计完成后分别在HeLa和HEK293细胞系进行了预实验,最终选择在HEK293细胞系开展两种基因回路的研究,结果显示在HEK293细胞系中:OFF Switch具有较弱的阿魏酸(钠)可诱导的下降趋势(约为3倍);ON Switch具有较高的诱导效率,但是在阿魏酸钠浓度为200 μM时,ON Switch时的诱导灵敏度依然处于较低水平(约为4倍)。为获得较高诱导效率的OFF Switch和ON Switch,对两种基因回路进行了进一步优化。对于OFF Switch,我们将转录激活结构域VP64代替VP16,随后报告系统上的操纵子进行1-6拷贝数的变化。然后,我们将效应模块上的启动子PSV40更换为PhCMV,但是结果并不理想,因此我们尝试改变融合蛋白aPadR(VP64-PadR)之间的linker氨基酸序列,最终发现Lk4的版本具有最高的诱导效率和灵敏度。对于ON Switch,我们分别对四种不同形式的操纵子序列(OpadR,OpadR(R),OpadR(C),OpadR(RC))开展实验,发现 OpadR 和 OpadR(RC)都能参与构成ON Switch。为获得更高的整体诱导效率和灵敏度,分别构建三明治形式(夹心结构)的报告系统以及改变转录抑制子iPadR(KRAB-PadR)之间的linker氨基酸序列,最终得到Lk20参与组成的最佳版本。OFF Switch和ON Switch的动力学表征研究结果显示,OFF Switch和ON Switch都具有较低的孵育时间依赖性和较低剂量依赖性,同时稳转株都具有较高的诱导效率和良好的可逆性。在不同类型的诱导物调控实验中,发现阿魏酸、阿魏酸钠以及阿魏酸钠药片对OFF Switch和ON Switch都具有诱导调控效果。同时,OFF Switch和ON Switch都可以在5种细胞系工作运行,证实两者都具有广谱细胞系适用性。再次,阿魏酸调控基因环路应用于体外阿魏酸与苯甲酸的双输入逻辑运算器,可以良好地进行AND,NAND,B NIMPLY A,ANIMPLY B及NOR门的逻辑运算。并且该系统在细胞水平上可以实现CRISPR-Cas9介导的内外源基因激活、抑制和切割,这对于未来在体内开展阿魏酸调控的基因编辑研究具有重大的意义。最后,将微胶囊包裹的稳转株细胞注入小鼠腹腔,三小时后腹腔注射或口服阿魏酸钠,结果证明15天后,阿魏酸钠可以在体内高效调控报告基因(SEAP)表达,为将来联合药物治疗及基于基因和细胞水平的治疗提供新思路和新策略。综上所述,本研究开发的阿魏酸正、负调控基因环路不仅在体外、体内都能高效、精准调控基因表达,而且能够实现高层次基因网络的逻辑运算和基因组操纵等多功能应用。本研究工作为哺乳动物细胞合成生物学提供了一个有力的小分子调控系统,丰富了合成生物学工具箱,为推动国内哺乳动物合成生物学研究以及阿魏酸调控的临床疾病治疗等奠定了一定的基础。