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果蝇脂肪体在体内广泛分布,承担了类似哺乳动物肝脏和脂肪组织的双重功能。脂肪体是能量储存和物质代谢的重要组织,整合和协同各种营养和激素信号,从而在整体水平上调控果蝇的生长发育。在果蝇变态发育过程中,脂肪体经历了显著的重建过程:幼虫脂肪体发生自噬、凋亡(自噬和凋亡是程序化细胞死亡的两种主要形式)和解离,并最终重组为成虫脂肪体。利用遗传手段特异性去除三龄末期的脂肪体,大部分果蝇蛹期致死,说明变态发育时期的脂肪体是果蝇生长发育所必须的。果蝇脂肪体自噬、凋亡、解离和重组的发育生物学研究报道甚少,其分子调控机理的探索几近空白。基于以上背景,我们研究了果蝇变态发育时期脂肪体重建的发育变化和分子调控机制,获得如下主要结果: 1.依据形态学特征可以把变态过程中的脂肪体重建划分为不同的发育阶段。果蝇变态(metamorphosis)包括受蜕皮激素(20-hydroxyedysone,20E)所诱导的成预蛹(pupariation,幼虫-预蛹转变)、化蛹(pupation,预蛹经头翻转转变为蛹,预蛹后12小时完成)、蛹期发育(成虫器官的重建),以及蛹羽化为成虫等四个发育过程。脂肪体在变态过程中依据其完整性可以大致分为三个发育阶段:完整的单细胞层逐渐解离(幼虫经预蛹直至化蛹)、逐渐解离成小细胞团(预蛹后12-36小时)、细胞团再发育为成虫脂肪体(预蛹后36小时至羽化为成虫)。虽然脂肪体都为完整的单细胞层,但以程序性细胞死亡程度又可以将脂肪体的第一发育阶段划分为幼虫至白色预蛹和预蛹后逐渐解离两段。在幼虫至白色预蛹阶段,蜕皮激素滴度剧烈上升,脂肪体中蜕皮激素信号通路及其诱导的自噬和凋亡基因的表达逐步上调,自噬程度和半胱天冬氨酸酶活性也逐渐增强。 2.利用三龄中后期至蛹期脂肪体特异性表达品系Lsp2-GAL4驱动蜕皮激素受体显性失活形式(EcRDN),超表达阻断蜕皮激素信号通路,发现能够同时抑制细胞自噬和半胱天冬氨酸酶活性,并导致部分果蝇蛹期死亡。同时抑制脂肪体细胞自噬和半胱天冬氨酸酶活性的果蝇,与阻断脂肪体蜕皮激素信号果蝇蛹期致死率相似,说明在幼虫至白色预蛹阶段中,受蜕皮激素诱导的细胞自噬和半胱天冬氨酸酶活性是蜕皮激素调控脂肪体重建,进而调控整个蛹期发育的关键。 3.虽然脂肪体的自噬和半胱天冬氨酸蛋白酶(caspase)活性在果蝇变态发育过程当中发挥着重要的作用,但上述实验也说明它们不能单独主导而只是部分参与了蜕皮激素诱导的脂肪体重建。随后,发现阻断脂肪体细胞自噬后,半胱天冬氨酸酶活性显著上升,抑制半胱天冬氨酸酶则细胞自噬明显增强,揭示在这一阶段两种程序性细胞死亡之间存在互相拮抗的“跷跷板”机制。而这一机制对脂肪体蛹期发育有重要意义:自噬抑制半胱天冬氨酸酶活性,防止细胞过早凋亡,保证脂肪体功能的正常进行;一定程度的半胱天冬氨酸酶活性抑制自噬,有助于防止过度的自噬而过早死亡,实现细胞挽救。 4.进一步研究发现,蜕皮激素初级反应基因E93是介导蜕皮激素诱导细胞自噬和半胱天冬氨酸酶的重要因子。在基因沉默E93和突变E93后,自噬和半胱天冬氨酸酶都明显受到抑制;过表达E93能够有效增强自噬和半胱天冬氨酸酶活性;在过表达EcRDN以抑制蜕皮激素信号的背景下同时过表达E93能够部分挽救自噬和caspases被抑制的表型。实时定量PCR检测显示,HTH转录因子E93对蜕皮激素信号、自噬和caspases相关基因具有转录促进作用;Western-blot检测表明,E93能够抑制PI3K-TORC1信号通路而诱导自噬启动。 综上,在本论文中,我们对幼虫至白色预蛹转化阶段的脂肪体进行了一系列的遗传操作,发现自噬和半胱天冬氨酸酶响应蜕皮激素信号而上调、进而调控脂肪体重建和整个蛹期发育进程,并且两者之间存在“跷跷板”作用,初级反应基因E93主导蜕皮激素对自噬和caspases的诱导作用。幼虫至白色预蛹转化阶段的果蝇脂肪体为研究自噬和凋亡的相互拮抗分子机制提供了一个很好的活体模型,在以后的研究中,将重点挖掘偶联自噬和caspases拮抗的关键分子机制,阐明E93的直接靶基因并鉴定其启动子区域的结合位点,填补蜕皮激素和E93抑制PI3 K-TORC1信号的中间步骤等。