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干扰素具有重要的抗病毒和免疫调节功能,目前已应用于人类多种疾病的临床治疗,是公认的较为有效的生物治疗药物之一。猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrheαvirus,PEDV)是危害世界养猪业的一种重要病原,属于冠状病毒,2011年出现新型变异毒株,并迅速呈现全国性大流行,造成我国哺乳仔猪大量死亡,给我国养猪业造成巨大损失。由于经典株疫苗免疫效果不理想,因此养猪生产中急切需要探索有效的防控技术,以解临床防控的当务之急。猪α-干扰素对猪传染性胃肠炎冠状病毒具有较好抗病毒效果。本研究以重组猪α-干扰素(rPoIFN-α)产业化为目标,对产业化发酵工艺生产、产品冻干保护剂、产品标准及检测方法进行了系统研究,证明rPoIFN-α在体内外PEDV感染有较好抗病毒效果,并优化了临床上产品使用方案,具有较好应用前景。本研究内容分为四个主要部分:1.毕赤酵母表达rPoIFN-α高密度发酵工艺研究为了建立毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIK9K-PoIFN-α产业化的发酵工艺,我们在实验室研究的基础上,应用100L的发酵罐摸索了分批发酵和补料发酵(以溶氧为信号进行控制)的生产工艺,研究比对了不同发酵工艺对工程菌生长以及重组蛋白分泌表达的影响。结果为:分批发酵方式下培养16h,蛋白表达量达到高峰为1.15mg/mL,蛋白活性8.69×106U/mL,之后蛋白表达量逐渐下降;在补料发酵方式下培养20h,蛋白表达量达高峰1.89mg/mL,蛋白活性5.29×107U/mL。补料发酵方式能够显著提高菌体密度及蛋白表达量,缩短发酵周期且蛋白活性优于分批发酵,具有很好应用价值。2.rPoIFN-α新型冻干保护剂及冻干工艺研究本试验通过对冻干保护剂配方、配苗比例及冻干曲线的对比研究,摸索rPoIFN-α冻干制剂的最佳的冻干工艺。结果显示,两种保护剂按照1:1的配苗比例分装,冻干曲线设定-40℃预冻5h,-40℃～-10℃升华10h,-10℃～2℃二次升华5 h,2℃～26℃解析干燥6 h,均可获得冻型稳定且剩余水分、真空度理想的rPoIFN-α冻干制剂。在冻干前后rPoIFN-α含量损失率方面,抗原活力稳定剂组冻干后含量降低0.13～0.89%,牛奶蔗糖保护剂组含量降低1.34～2.91%,显示在冻干过程中抗原活力稳定剂对rPoIFN-α具有更好的保护效果。此外通过对各试验组rPoIFN-α在2～8℃和37℃条件下进行保存期及加速稳定性试验,结果显示,牛奶蔗糖保护剂各试验组在2～8℃条件保存24个月或37℃条件保存10d,蛋白含量分别下降3～6%和2.5%～6%,蛋白活性平均下降约1～2个滴度;而抗原活力稳定剂各试验组在2～8℃条件保存24个月或37℃条件保存10d,蛋白含量下降小于1%,蛋白活性无变化。因此抗原活力稳定剂对rPoIFN-α的保存效果明显优于传统牛奶蔗糖保护剂。因此,选定抗原活力稳定剂作为该产品的冻干保护剂。3.rPoIFN-α冻干制剂的制备及其体外抗猪流行性腹泻病毒作用本研究制备3批rPoIFN-α冻干制品,采用牛肾细胞(MDBK)和水泡性口炎病毒(VSV)测定rPoIFN-此生物学活性为1×107U/mL。该产品冻干后性状、剩余水分、真空度、纯粹性、安全性检验均符合《中国兽药典》相关制品质量检验要求。采用rPoIFN-α制品,测定其体外抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株活性效果,采用2015012批次rPoIFN-α制品,测定其对PEDV的体外抑制效果,表明:(1)该批次rPoIFN-α在细胞上感作24h,对EBVAC15的阻断作用最明显,1个活性单位(107稀释)即可完全抑制病毒增殖;如果感作1h,则100个活性单位(105稀释)才可完全抑制病毒增殖。(2)rPoIFN-α和EBVAC15预混1 h后共感染细胞,1000个活性单位(104稀释)才可以完全抑制病毒增殖。(3)PEDV先感染细胞1h后,rPoIFN-α对病毒几乎无抑制作用。4.rPoIFN-α冻干制剂临床应用效果观察本研究选择猪流行性腹泻发病猪场,应用rPoIFN-α开展初生仔猪流行性腹泻病的临床防治试验。结果表明:应用rPoIFN-α对初生仔猪PED具有较好的防治作用,存活率可达50%～70%,比未处理病猪提高20%～40%。通过临床应用跟踪,对rPoIFN-α使用方案进行了优化,结果为:(1)rPoIFN-α用于发病早期紧急预防及治疗PEDV效果理想;(2)肌肉注射与口服治疗效果无明显差异,肌肉注射方式较口服便捷;(3)母猪和仔猪联用(母猪产前10 d和3d分别注射2.5头份rPoIFN-α,仔猪出生当天及第二天口服/注射1头份rPoIFN-α)预防效果明显优于母猪/仔猪单独使用;(4)PED发病中晚期时使用rPoIFN-α治疗效果不佳,其原因可能是由于仔猪发生PED中后期肠道已严重损伤,持续的腹泻引起机体严重脱水和酸中毒,仅用rPoIFN-α难以缓解脱水和酸中毒问题。综上所述,本研究建立了rPoIFN-α产业化生产工艺及体外效力检验方法,临床应用结果证明其对仔猪PED有较好治疗效果,并制定了本产品的猪场应用方案,为临床防治流行性腹泻提供了 一种新方法。