PSMA7基因编码的产物为人类蛋白酶体α7亚基(proteasome subunit, alpha type,7, PSMA7),该蛋白是20S蛋白酶体核心复合体的一个α亚基。作为蛋白酶体的一个亚基,PSMA7参与了HBV、HCV和HIV病毒的复制及多种蛋白质的降解,并与HBx、HIF-1、c-Ab1及Arg等多种肿瘤相关的重要蛋白质相互作用；此外该蛋白还参与膜蛋白的转运及对蛋白酶体活性的调节等。PSMA7基因位于20号染色体(20q13.33),一个与多种癌症基因的扩增屡次相关的染色体区,人类肿瘤普遍伴随20q的扩增,但PSMA7在肿瘤方面的研究目前国内外鲜有报道,为了阐明其确切功能,本课题拟以该基因对肺腺癌A549细胞系生物学行为及裸鼠移植瘤生长的影响为切入点,将PSMA7的cDNA全长克隆入真核表达载体,转染A549细胞系,设计一系列实验观察其对肿瘤细胞生长、增殖及侵袭等的影响,并且利用siRNA技术,在A549细胞中抑制PSMA7蛋白的表达,观察干扰后细胞生物学行为的改变,从多个角度了解并验证其功能。最终揭本基因编码蛋白的生物学功能,并初步探讨其发挥作用的机制,从而为全面研究PSMA7的功能及在肿瘤中的作用奠定基础。方法：1. PSMA7的表达谱和亚细胞定位1.1 Western-blot检测多种肿瘤细胞株中PSMA7的定位。1.2构建pDsRed1-C3/PSMA7真核表达载体并观察其在786-0及293T细胞株中的亚细胞定位,同时采用细胞免疫荧光技术检测PSMA7在Lovo、HBE135-E6E7、A549细胞中的亚细胞定位。1.3免疫组化检测肺癌组织标本中PSMA7的表达。2.过表达PSMA7的相关实验2.1重组质粒pcDNA3.1(-)/PSMA7的构建及稳定表达细胞株的建立：用RT-PCR法从正常支气管上皮细胞株HBE135-E6E7中钓取目的基因,把目的基因连接到pMD18-T载体。经PCR、双酶切鉴定后,将双酶切后的目的片段与真核表达载体pcDNA3.1(-)相连,得到重组质粒pcDNA3.1(-)/PSMA7,再双酶切重组质粒,测序正确后转染A549细胞,用G418筛选出稳定表达株,采用RT-PCR和Westren blot法分别从：mRNA和蛋白水平检测稳定细胞株中PSMA7的表达情况,筛选获得的过表达PSMA7的稳定株用于后续实验。2.2 MTT法分别检测稳定转染PSMA7目的基因的A549细胞(A549/pcDNA3.1(-)/PSMA7)和转染空载体pcDNA3.1(-)的A549细胞(A549/pcDNA3.1(-))的生长特性；流式细胞仪分析过表达PSMA7对细胞周期和细胞凋亡的影响；平板克隆形成实验检测两组细胞的克隆形成能力；Transwell法检测过表达PSMA7对细胞侵袭力的影响；流式细胞仪检测粘附因子ICAM-1的表达。2.3将A549/pcDNA3.1(-)细胞和A549/pcDNA3.1(-)/PSMA7细胞分别注射至裸鼠前肢腋部皮下左右两侧,构建裸鼠移植瘤同体对照模型,观察移植瘤的生长速度和体积等情况。3.siRNA靶向抑制PSMA7的相关实验3。1将PSMA7干扰重组质粒转染A549细胞,用潮霉素筛选出稳定表达株,并经Western blot鉴定,选出干扰效果最佳的低表达稳定株于后续实验。3.2 MTT法观察siRNA靶向抑制PSMA7表达后A549细胞的增殖情况并绘制细胞生长曲线；流式细胞仪检测低表达PSMA7对细胞周期和凋亡的影响；平板克隆形成实验检测克隆形成率；Tanswell法检测侵袭能力；流式细胞仪检测ICAM-1的表达。3.3观察siRNA靶向抑制PSMA7后对裸鼠成瘤的影响。结果：1.亚细胞定位1.1 PSMA7在肿瘤细胞中广泛表达,具有一定的组织特异性。1.2成功构建pDsRed1-C3/PSMA7真核表达载体并转染入786-0和293T细胞株中。荧光显微镜发现融合表达蛋白PSMA7定位于胞浆和胞核,不同细胞株定位有差异。1.3细胞免疫荧光技术发现PSMA7在Lovo细胞的胞浆和胞核中均有分布,以胞浆明显。在A549细胞中主要定位于胞浆,胞核中少见,而HBE135-E6E7中的定位以胞浆为主,在胞核中也有较多分布。1.4免疫组织化学分析提示PSMA7定位于非小细胞肺癌组织的胞浆和胞核。2.过表达PSMA7的相关实验2.1成功构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/PSMA7.用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1(-)/PSMA7转染入A549细胞,经G418筛选后,采用RT-PCR检测发现,与未转染A549细胞组和转pcDNA3.1(-)组相比较,转pcDNA3.1(-)/PSMA7组PSMA7的mRNA表达水平显著增高,具有统计学意义(P<0.05),但前两者间无显著差异(P>0.05)。Western Blot检测亦显同样的结果,说明成功获得过表达PSMA7的稳定细胞株。2.2增殖实验显示,A549/pcDNA3.1(-)组和A549/pcDNA3.1(-)/PSMA7组间比较有统计学差异(F=3451.158,P=0.000),与A549/pcDNA3.1(-)组相比,A549/pcDNA3.1(-)/PSMA7组的OD值均降低,说明与A549/pcDNA3.1(-)细胞相比,A549/pcDNA3.1(-)/PSMA7细胞的生长速度减慢,提示过表达PSMA7能抑制肿瘤细胞的增殖；流式细胞仪检测各组细胞周期时相,发现两组细胞周期时相没有显著差异(P均>0.05),而在顺铂诱导的凋亡实验中发现过表达PSMA7能够促进A549细胞凋亡(F=63.951,P=0.000)。平板克隆形成实验显示,过表达PSMA7后A549细胞的克隆形成能力降低(t=2.863,P=0.046)。Transwell实验显示过表达PSMA7可降低肿瘤细胞的侵袭力(t=3.236,P=0.032)。通过流式细胞仪检测发现过表达PSMA7后A549细胞表达ICAM-1的能力降低(t=86.325,P=0.000)。2.3通过向裸鼠前肢腋部皮下注射各组A549细胞,成功建立同体对照的裸鼠移植瘤模型。结果显示,注射A549/pcDNA3.1(-)/PSMA7细胞组比注射A549/pcDNA3.1(-)细胞组的裸鼠瘤体生长速度慢,体积小(t=-4.636,P=0.006)。3.siRNA靶向抑制PSMA7的相关实验3.1 Western blot检测发现RNA干扰后转染细胞的PSMA7蛋白水平发生了改变(F=13.849, P=0.000), pGPU6/Hygro-PSMA7-265和pGPU6/Hygro-PSMA7-929质粒均有效抑制了A549细胞中PSMA7蛋白的表达水平(P均<0.05),其中pGPU6/Hygro-PSMA7-265干扰效果最佳,干扰率达69.37%。因此选pGPU6/Hygro-PSMA7-265作后续试验,并命名为shPSMA7,同时阴性对照pGPU6/Hygro-SHNC命名为shNC。3.2增殖实验显示,与shNC细胞相比,shPSMA7细胞的生长速度较快(F=11.748,P=0.000),提示干扰PSMA7表达能促进A549细胞的增殖；流式细胞仪检测细胞周期时相,发现与shNC组相比,shPSMA7组细胞的G1、G2期细胞比例均降低,而S期的值增高(P均<0.05),说明A549细胞经干扰后与未干扰的A549细胞相比,较早进入S期,提示其生长速度加快。siRNA靶向抑制PSMA7后对顺铂诱导凋亡的影响不大(F=0.336,P=0.570)。平板克隆形成实验显示,shPSMA7细胞克隆形成力高于shNC细胞(t=-2.747, P=0.033); Transwell实验显示shPSMA7组侵袭能力增加(t=-3.080,P=0.037),提示靶向抑制PSMA7表达可增加A549细胞的侵袭力。流细胞仪检测发现靶向抑制PSMA7表达后A549细胞表达ICAM-1的能力显著增强(t=-119.827,P=0.000)。3.3通过向裸鼠前肢腋部皮下注射各组A549细胞,成功建立同体对照裸鼠移植瘤模型。结果显示,注射shPSMA7细胞组比注射shNC细胞组的裸鼠瘤体生长速度快,体积大(t=3.216,P=0.024)结论：过表达PSMA7基因可以抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡,降低其克隆形成能力、侵袭能力、ICAM-1分泌能力等,并抑制移植瘤形成；靶向抑制PSMA7可促进A549细胞的增殖、提高其克隆形成能力、侵袭力、分泌ICAM-1能力以及移植瘤形成能力。提示PSMA7可能是一个肿瘤相关蛋白,与肺癌的发生、发展密切相关,从而为肺癌的防治提供了新的思路和干预靶点,为更深入的机制研究奠定了良好基础。