背景脑膜癌病（Meningeal carcinomatosis,MC）是指各种恶性肿瘤转移至硬脑膜、软脑膜、脑脊液及蛛网膜下腔,一般脑和脊髓内并无瘤块,它是一种特殊类型的中枢神经系统（Central nervous system,CNS）转移癌,属于癌症患者晚期阶段严重的中枢神经系统并发症。在实体肿瘤患者中,大概有10%～30%的患者会发生中枢神经系统的转移,其中4%～15%表现为脑膜癌病。脑膜癌病恶性程度高,预后差,其发病率近年来呈上升趋势。早期诊断和治疗是提高脑膜癌病的疗效、降低死亡率的关键。MC起病隐匿,神经系统症状和影像学表现无特异性,其诊断具有挑战性,尽管对脑膜癌病的风险及临床表现已有深入的了解,但目前MC的发生与诊断在临床实践中仍然被低估,且目前对于评估软脑膜空间肿瘤负荷尚缺乏很好的量化指标。在解决这一难题的研究过程中,众多研究者被“肿瘤微环境”（Tumor Microenvironment,TME）这一概念的提出所吸引。“肿瘤微环境”由肿瘤细胞、周围的间质细胞、细胞外基质和信号分子组成。TME提供肿瘤生长的环境,肿瘤细胞可与微环境发生相互作用,改变微环境中的细胞谱及各种分子水平。对于MC而言,与蛛网膜空间的肿瘤接触的直接介质是脑脊液（Cerebrospinal fluid,CSF）,我们通过对CSF进行分析,可以进一步探索MC的“肿瘤微环境”,从而有助于MC的诊断、疾病监测及治疗反应评估。目前,关于TME的研究主要是集中于实体瘤颅外转移灶,关于CNS转移的研究很少,尚无针对于MC微环境的相关研究。而外泌体是TME的重要非细胞组成部分,也是近年来的研究热点。外泌体是细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EV）的一种,是几乎所有细胞分泌的一种细胞外膜微囊,直径在30-150nm之间,含有各种内源性物质,如蛋白质,脂质和遗传物质,在生理和病理条件下都大量存在于我们的体内。外泌体是肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞之间细胞内通讯的重要介质,在抗原呈递、信号转导和废物处理等多个细胞过程中起着关键作用。外泌体含量稳定,可被转运到受体细胞发挥其生物学作用。各种重要的细胞信号分子,如DNA、RNA、蛋白质等都可以通过外泌体进行携带和传递。因此,外泌体衍生的RNA信号谱和蛋白质组学通常被用来解释疾病的分子调控机制,并可作为反映其组织疾病状况的生物标志物。在过去的几十年中,众多研究致力于揭示外泌体在调节肿瘤发生和发展中的机制,以及发掘新的的生物标记物和治疗靶点。越来越多的证据也表明,宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移,然而,外泌体的精确功能在很大程度上仍然未知。许多研究集中在外泌体差异细胞成分的功能上,这些差异细胞成分可以通过促进肿瘤细胞的生长、侵袭、转移、肿瘤血管生成甚至肿瘤发生而促进肿瘤进展,尤其是非编码RNA（Noncoding RNA,ncRNA）,是近年来研究的热点。外泌体ncRNA分子如长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lncRNA）、微小 RNA（MicroRNA,miRNA）和环状 RNA（Circular RNA,circRNA）是极具应用前景的新的肿瘤生物标记物和治疗靶点。那么外泌体RNA是否参与了脑膜癌病的发生与发展,它们是否有作为脑膜癌病诊断的新的分子生物标志物的潜力呢?目前这些方面的研究尚不充分。目的本研究拟采用高通量测序技术（High-throughputsequencing）分析脑膜癌病患者的脑脊液和健康对照组的脑脊液中外泌体RNA的表达谱,探索脑膜癌病患者与健康志愿者的脑脊液中外泌体RNA表达谱是否存在差异,并通过生物信息学分析,如GO（Gene Ontology）功能注释分析和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析等进一步明确这些差异表达的RNA分子的生物学功能、相关基因富集参与的信号通路,并构建其相互作用预测网络图,以探索外泌体RNA参与脑膜癌病发生、发展的分子机制。方法1.研究对象收集2018年5月至2021年6月就诊于山东大学第二医院的脑膜癌病患者35例,诊断标准依据中华医学会神经病学分会感染性疾病与脑脊液细胞学学组《脑膜癌病诊断专家共识》。为保证研究结果同质化,本研究选取其中转移自肺腺癌的脑膜癌病患者18例组成脑膜癌病例组（18例患者均具有明确的肺腺癌病史,有新近出现的神经系统症状和体征,腰椎穿刺行脑脊液细胞学检查阳性）,选取年龄、性别相匹配的健康志愿者18例作为健康对照组,本研究通过山东大学第二医院伦理委员会批准,所有脑膜癌病患者及健康志愿者均签署知情同意书。2.标本采集通过腰椎穿刺术留取脑膜癌病例组与健康对照组的脑脊液标本,冻存于-80℃冰箱备用。随机选取其中3例转移自肺腺癌的脑膜癌病患者及3例健康志愿者的脑脊液样本（每例脑脊液标本至少5ml）,用于脑脊液外泌体RNA的高通量全转录组测序。3.脑脊液外泌体的提取及鉴定应用MinuteTM高效外泌体分离试剂分别提取脑膜癌病例组与健康对照组的脑脊液标本中的外泌体;通过透射电镜扫描鉴定外泌体,并对外泌体标志物CD63、TSG101采用Western Blot方法鉴定。4.外泌体总RNA提取应用Trizol法分别抽提3例脑膜癌患者及3例健康志愿者的脑脊液外泌体的总RNA,用于高通量全转录组测序。5.脑脊液外泌体RNA转录组文库构建和测序5.1脑脊液外泌体mRNA、lncRNA和circRNA的转录组测序:将总RNA中的rRNAs 应用 Ribo-Zero rRNA Removal Kits 移除。对 RNA 使用TruSeq Stranded Total RNALibrary Prep Kit（Illumina,美国）进行预处理,构建测序文库。使用BioAnalyzer 2100仪器（Agilent Technologies,美国）对文库进行质控和定量。根据Illumina测序说明,将10 pM文库变性为单链DNA分子,在Illumina flowcell上捕获后,原位扩增为簇（cluster）,并采用双端模式（PE mode）在 Illumina HiSeq 4000 测序仪（Illumina,美国）上进行150 cycle测序。5.2脑脊液外泌体miRNA测序:使用每个样品的总RNA制备miRNA测序文库,包括以下几个步骤:1)3’接头连接;2)5’接头连接;3)cDNA合成;4)PCR扩增;5)回收～150 bp的PCR扩增片段（对应～22 nt的miRNAs）;将文库变性为单链DNA分子,在Illumina flow cell上捕获,原位扩增为簇（cluster）,并根据供应商的操作说明,在Illumina NovaSeq 4000测序仪上进行50 cycle测序。6.生物信息学分析及部分验证实验6.1 mRNA测序数据分析及验证:将高质量reads使用hisat2软件（v2.1）比对到人参考基因组（UCSC HG19）上。然后,在ensembl gtf基因注释文件指导下,使用cuffdiff 软件获得基因水平 mRNA 的 FPKM（Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）值,作为mRNA的表达谱,并计算两组标本间的倍数变化和P-value以筛选差异表达的mRNA,并进行差异mRNA的GO和KEGG通路分析。通过荧光定量RT-PCR验证脑膜癌病组与健康对照组另外15对脑脊液的混样标本中6个目标外泌体mRNA的相对表达水平。6.2 lncRNA测序数据分析:将高质量reads使用hisat2软件（v2.1）比对到人参考基因组（UCSCHG19）上。然后,在ensembl gtf基因注释文件指导下,使用cuffdiff软件获得转录本水平 lncRNA 的 FPKM（Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）值,作为lncRNA的表达谱,并计算两组标本间的倍数变化和P-value以筛选差异表达lncRNA。根据临近关系,预测lncRNA的靶基因,进行靶基因的GO和KEGG通路分析。利用miRcode数据库进行差异lncRNA-miRNA相互作用预测,应用Cytoscape软件构建4个上调与5个下调的目标lncRNA的lncRNA-miRNA的预测网络图。6.3 miRNA测序数据分析:经过Illumina测序仪测序,图像分析,碱基识别后,收获经过质控后的原始reads。使用cutadapt软件（v1.9.3）对原始reads进行去接头,去低质量reads,保留长度＞=15 nt的reads,得到去接头后的reads（即trimmed reads）。然后,合并所有样品的trimmed reads,利用miRDeep2软件（v2.0.0.5）进行新miRNA预测。使用Novoalign软件（v3.02.12）将每个样品的trimmedreads比对到合并的人类pre-miRNAs数据库上,最多允许1处错配。统计比对到每条成熟miRNA上的tag数作为该 miRNA 的原始表达量,并使用 TPM（tag counts per million aligned miRNAs）方法进行标准化。计算两个样品间的Fold change,并筛选差异表达miRNAs。计算两组标本（有重复）间的P-value和Fold Change,并筛选差异表达miRNAs。利用基于miRanda和TargetScan的miRNA靶基因预测软件预测前10位已知差异miRNA的靶基因,并进行靶基因的GO功能分析和Pathway分析,应用Cytoscape软件构建前5位差异表达外泌体miRNA的靶基因预测网络图。6.4 circRNA测序数据分析及验证:使用STAR软件将高质量reads 比对到参考基因组/转录组上,使用DCC软件进行环状RNA检测和鉴定。并使用circBase数据库对所鉴定的环状RNA进行注释。再使用edgeR软件进行数据标准化和差异表达circRNA筛选。并进行差异环状RNAs来源基因的GO和KEGG分析。通过荧光定量RT-PCR验证脑膜癌病例组与健康对照组另外15对脑脊液的混样标本中5个目标外泌体circRNA的相对表达水平。利用基于miRanda和TargetScan的miRNA靶基因预测软件进行差异circRNA-miRNA相互作用预测,应用Cytoscape软件构建5个目标circRNA-miRNA的预测网络图。结果1.外泌体鉴定我们使用MinuteTM高效外泌体分离试剂盒,从脑膜癌病例组和健康对照组的脑脊液中分离出外泌体,通过透射电子显微镜可以观察到直径约为60-100 nm的脂质双层小囊泡。Western blot分析证实了外泌体标志性蛋白CD63和TSG101的存在,证实我们分离到的囊性小泡是外泌体。2.RNA高通量测序及分析提取外泌体总RNA后,对脑膜癌病例组和健康对照组的脑脊液外泌体RNA进行高通量测序和生物信息学分析及部分验证。2.1脑膜癌病患者脑脊液中外泌体mRNA表达谱的差异分析2.1.1通过对脑膜癌病患者的脑脊液中外泌体mRNA表达谱与正常对照组的脑脊液中外泌体mRNA表达谱进行对比分析,最终共鉴定出20308个mRNA。与正常对照组相比,脑膜癌病组的脑脊液中有3845个差异表达的外泌体mRNA,包括896个上调的外泌体mRNA和2949个下调的外泌体mRNA。2.1.2对上调表达的外泌体mRNA进行GO分析,生物过程（Biological Process,BP）中富集最显著的前三位 GO terms 是 cellular response to chemical stimulus（细胞对化学刺激的反应）、interspecies interaction between organisms（组织间的相互作用）和symbiont process（共生过程）;细胞组分（Cell Component,CC）中富集最显著的前三位 GO terms 是 extracellular exosome（胞外外泌体）、extracellularvesicle（细胞外小泡）和 extracellular organelle（细胞外细胞器）;分子功能（Molecular Function,MF）中富集最显著的前三位GO terms是protein binding（蛋白质结合）,enzyme binding（酶结合）和cell adhesion moleculebinding（细胞粘附分子结合）。对下调表达的外泌体mRNA进行GO分析,BP中富集最显著的前三位GO terms是multicellular organismal process（多细胞生物过程）,nervous system process（神经系统过程）和system process（系统过程）;CC中富集最显著的前三位GO terms是intrinsic component of membrane（膜的固有成分）,integral component ofmembrane（膜的组成部分）和 plasma membrane（质膜）;MF中富集最显著的前三位GO terms是signaling receptor activity（信号受体活性）,molecular transducer activity（分子传感器活性）和 transmembrane signaling receptor activity（跨膜信号受体活性）。2.1.3对上调表达的外泌体mRNA进行KEGG分析,富集前5位的通路是:HIF-1 signaling pathway（HIF-1 信号通路）、Staphylococcus aureus infection（金黄色葡萄球菌感染）、Complementandcoagulationcascades（补体和凝血级联）、TNF signalingpathway（肿瘤坏死因子信号通路）、Herpes simplex infection（单纯疱疹感染）通路;对下调表达的外泌体mRNA进行KEGG分析,富集前5位的通路是:Neuroactive ligand-receptor interaction（神经活性配体受体相互作用）、Olfactory transduction（嗅觉传导）、Nicotine addiction（尼古丁成瘾）、Hedgehog signalingpathway（Hedgehog 信号通路）和 Calcium signaling pathway（钙离子信号通路）、Basal cell carcinoma（基底细胞癌）通路。2.1.4根据KEGG分析和KEGG数据库检索的结果建立差异表达的外泌体mRNA富集的前10条重要通路的通路关系网络分析图,显示核心下游通路是钙离子信号通路,其上游主要癌症相关信号通路是HIF-1通路和cAMP信号通路。2.1.5.通过RT-qPCR验证脑膜癌病组与健康对照组另外15对脑脊液的混样标本中6个目标外泌体mRNA的相对表达水平,结果显示,与健康对照组相比,脑膜癌病例组的脑脊液外泌体中PI3K、CASP3和CASP8的mRNA表达水平显著上调（P＜0.05）,而NETRIN1、AMPA和SHANK的mRNA表达水平显著下调（P＜0.05）,与高通量测序数据一致。2.2脑膜癌病患者脑脊液中外泌体lncRNA表达谱的差异分析2.2.1通过对脑膜癌病患者的脑脊液中外泌体lncRNA表达谱与正常对照组的脑脊液中外泌体lncRNA表达谱进行对比分析,最终共鉴定出37684个lncRNA。与正常对照组相比,脑膜癌病组的脑脊液中有1183个差异表达的外泌体lncRNA,包括12个上调的外泌体lncRNA和1171个下调的外泌体lncRNA。2.2.2 对上调表达的外泌体lncRNA的靶基因进行GO分析,结果显示,BP中富集最显著的前三位 GO terms 是 positive regulation of intracellular estrogen receptor signaling pathway（细胞内雌激素受体信号通路的正调控）、regulation of cholesterol esterification（胆固醇醇化的调节）和 negative regulation of protein autophosphorylation（蛋白质自身磷酸化的负调控）;CC中富集最显著的前三位GO terms是MLL3/4 complex（MLL3/4 复合体）、chylomicron（柱状体）和 very-low-density lipoprotein particle（极低密度脂蛋白颗粒）;MF中富集最显著的前三位GO terms是phospholipase inhibitor activity（磷脂酶抑制剂活性）、lipase inhibitor activity（脂肪酶抑制剂活性）和phosphatidylcholine binding（磷脂酰胆碱结合）。对下调表达的外泌体lncRNA的靶基因进行GO分析,BP中富集最显著的前三位GO terms是protein localization to plasma membrane（蛋白质在质膜上的定位）、protein localization to cell periphery（蛋白质在细胞外周的定位）和cell surface receptor signaling pathway（细胞表面受体信号通路）;CC中富集最显著的前三位GO terms是actin cytoskeleton（细胞骨架肌动蛋白）、neuronal cell body（神经元细胞体）和 plasma membrane bounded cell projection（质膜有界细胞投影）;MF中富集最显著的前三位GO terms是enzyme binding（酶结合）、protein self-association（蛋 白质自 结合）和 collagen binding（胶 原结合）。2.2.3 对下调表达的外泌体lncRNA临近靶基因进行KEGG分析,按照富集分数从高到低,显著富集的7条通路分别为:Amyotrophic lateral sclerosis（ALS）（肌萎缩侧索硬化症）、Amphetamine addiction（苯丙胺成瘾）、Adipocytokine signaling pathway（脂肪细胞因子信号通路）、Dopaminergic synapse（多巴胺能突触）、Peroxisome（过氧化物酶体）、Hypertrophic cardiomyopathy（肥厚型心肌病）和 Nicotine addiction（尼古丁成瘾）通路。2.2.4 基于miRcode数据库,应用Cytoscape软件构建了 4个目标上调和5个下调的外泌体lncRNA的靶点miRNA预测网络图。2.3脑膜癌病患者脑脊液中外泌体miRNA表达谱的差异分析2.3.1 通过对脑膜癌病患者的脑脊液中外泌体miRNA表达谱与正常对照组的脑脊液中外泌体miRNA表达谱进行对比分析,最终共鉴定出431个外泌体miRNA,其中161个为预测的新miRNA。与正常对照组相比,脑膜癌病组的脑脊液中有14个差异表达的外泌体miRNA,包括6个上调的外泌体miRNA和8个下调的外泌体miRNA。2.3.2 对上调表达的外泌体miRNA的靶基因进行GO分析,BP中富集最显著的前三位 GO terms 是 localization（定位）、generationofneurons（神经元的产生）和 nervous system development（神经系统发育）;CC中富集最显著的前三位GO terms是transporter complex（转运复合物）、celljunction（细胞连接）和 transmembrane transporter complex（跨膜转运蛋白复合物）;MF中富集最显著的前三位GO terms是protein binding（蛋白质结合）、cAMP binding（环磷酸腺苷结合）和 phospholipid scramblase activity（磷脂酶活性）。对下调表达的外泌体miRNA的靶基因进行GO分析,BP中富集最显著的前三位 GO terms 是 positive regulation of cellular extravasation（细胞外渗的正调控）、positive regulation ofcell-cell adhesion（细胞间粘附的正调控）和 T cell differentiation（T 细胞分化）;CC 中富集最显著的前三位 GO terms 是 integral component of plasma membrane（质膜的组成部分）、intrinsic component of plasma membrane（质膜固有组成部分）和cell surface（细胞表面）;MF中富集最显著的前三位GO terms是solute:cation symporter activity（溶质:阳离子转运体活性）、solute:sodium symporter activity（溶质:钠离子转运体活性）和symporter activity（转运体活性）。2.3.3 对上调表达的外泌体miRNA的靶基因进行KEGG分析,按照富集分数从高到低,显著富集的前5位通路分别为:Proteoglycans in cancer（癌症中的蛋白多糖）、Glutamatergic synapse（谷氨酸能突触）、Dopaminergic synapse（多巴胺能突触）、Hippo signaling pathway（Hippo 信号通路）、cGMP-PKG signaling pathway（cGMP-PKG 信号通路）;对下调表达的外泌体miRNA的靶基因进行KEGG分析,按照富集分数从高到低,显著富集的前5位通路分别为:Wntsignalingpathway（Wnt信号通路）、Oocyte meiosis（卵母细胞减数分裂）、Progesterone-mediatedoocytematuration（孕酮介导的卵母细胞成熟）、Pathways in cancer（癌症的相关通路）和HTLV-Ⅰ infection（人类T淋巴细胞白血病病毒-Ⅰ感染）通路。2.3.4利用基于miRanda和TargetScan的miRNA靶基因预测软件预测前10位差异miRNA的靶基因,应用Cytoscape软件构建了前5位上调和下调外泌体miRNA的靶基因预测网络图。2.4脑膜癌病患者脑脊液中外泌体circRNA表达谱的差异分析2.4.1 通过对脑膜癌病患者的脑脊液中外泌体circRNA表达谱与正常对照组的脑脊液中外泌体circRNA表达谱进行对比分析,最终共鉴定到12503个circRNA,其中大多数是新鉴定的circRNA（n=8940）。与健康对照组相比,脑膜癌病例组的脑脊液外泌体中有39个差异表达的circRNA,包括34个上调的外泌体circRNA和5个下调的外泌体circRNA。2.4.2 对上调表达的34个外泌体circRNA来源基因进行GO分析,结果显示,BP中富集最显著的前三位 GO terms 是 lipidstorage（脂质储存）、regulationoflipid storage（脂质储存的调节）和androgen receptor signaling pathway（雄激素受体信号通路）;CC中富集最显著的前三位GO terms是nucleoplasm（核质）、nuclear lumen（核腔）和membrane-enclosed lumen（膜封闭腔）;MF中富集最显著的前三位GO terms是transcription cofactor activity（转录辅因子）、transcription factor activity:transcription factor binding（转录因子活性,转录因子结合）和 transcription factor activity:protein binding（转录因子活性,蛋白质结合）。2.4.3 对上调表达的外泌体circRNA来源基因进行KEGG分析,按照富集分数从高到低,显著富集的前10位通路分别为:Phagosome（吞噬体）、Allograft rejection（同种异体排斥）、Graft-versus-host disease（移植物抗宿主病）、Type I diabetes mellitus 和herpes simplex infection（Ⅰ 型糖尿病和单纯疱疹感染）、Autoimmune thyroid disease（自身免疫性甲状腺疾病）、Staphylococcus aureus infection（金黄色葡萄球菌感染）、Viral myocarditis（病毒性心肌炎）、Aminoacyl-tRNA biosynthesis（氨酰 tRNA 生物合成）和Leishmaniasis（利什曼病）通路。2.4.4 通过RT-qPCR验证脑膜癌病组与健康对照组另外15对脑脊液的混样标本中5个目标外泌体circRNA的相对表达水平,结果显示,与健康对照组相比,脑膜癌病例组的 5 个目标外泌体 circRNA:chr6:31238163-31323269-、hsacirc0001451、chr1:231928640-231954263+、hsacirc0001861 和 hsacirc0001181 的表达均显著上调（P＜0.05）,与高通量测序数据一致。2.4.5 应用基于miRanda和TargetScan数据库的miRNA靶基因预测软件,进行了差异circRNA-miRNA相互作用预测,应用Cytoscape软件构建了 5个目标外泌体circRNA的circRNA-miRNA相互作用预测网络图。结论本研究通过高通量测序研究发现,脑膜癌病患者的脑脊液外泌体与正常对照组的脑脊液外泌体有各自特征性的RNA表达谱,生物信息学分析筛选出的差异表达的外泌体RNA分子,包括mRNA、lncRNA、miRNA及circRNA可能在脑膜癌病的发生、发展中发挥重要作用。通过建立脑膜癌病患者的脑脊液外泌体mRNA、lncRNA、miRNA及circRNA差异基因的表达谱,对其进行GO功能注释和KEGG通路分析,并构建其相互作用预测网络图,为后续脑膜癌病的外泌体基因学、蛋白学及分子生物学研究提供了理论依据,并提供潜在的脑膜癌病的候选分子诊断标志物。