研究背景体内外观察以及动物实验均表明细胞免疫反应在控制HIV-1病毒复制过程中发挥了重要的作用,CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxic T Iymphoxyte, CTL）通过识别HIV-1感染细胞表面由HLA-Ⅰ类分子提呈的抗原肽表位杀伤受感染细胞。HIV-1为了适应HLA-Ⅰ类分子介导的免疫压力而进化出一系列策略来逃逸CTL反应的识别和杀伤。理论上,成功逃逸宿主细胞免疫反应的突变株应该具有复制优势,然而有研究显示某些HLA-Ⅰ类分子介导的CTL逃逸突变株会引起病毒复制能力的下降,病毒复制能力的下降与逃逸突变损伤病毒的适应性有关。近年来,随着统计分析方法的不断发展和完善,研究人员发现在群体水平上HLA-Ⅰ类分子介导的免疫逃逸突变模式可根据宿主的HLA背景进行预测。目前,利用进化校正的Logistic回归分析方法已在HIV-1 Gag/Pol/Nef基因上鉴定了大量的HLA-Ⅰ类分子介导的免疫逃逸突变位点（HLA associated polymorphism, HLA-APs）,然而有关亚洲人群HLA-Ⅰ介导的免疫逃逸研究报道较少,本文分析了我国HIV-1 B’亚型毒株感染者Nef蛋白HLA-Ⅰ相关的多态性位点的分布特征及其与临床指标的相关性,以期为HIV-1免疫致病机制研究和基于T细胞免疫应答的疫苗设计提供参考信息。研究目的1、通过进化校正的Logistic回归分析方法鉴定HIV-1 B’亚型毒株Nef蛋白HLA-Ⅰ介导的免疫逃逸突变位点；2、分析我国HIV-1 B’亚型毒株Nef蛋白HLA-Ⅰ免疫压力下逃逸突变位点的分布和变异特征,并分析HLA-Ⅰ相关突变位点与CD4 T细胞计数和血浆病毒载量的相关性。研究方法研究对象：本研究一共纳入了163名未接受抗病毒治疗的HIV-1慢性感染者,主要通过既往不规范的采浆途径而感染。在所有研究对象知情同意的情况下,由实验室人员抽取研究对象的静脉血用于本次研究。另外,本次研究获得了中心伦理委员会的同意。实验方法：研究对象的全血用于检测CD4+T细胞计数以及HLA分型（HLA分型主要采用序列特异引物引导的PCR反应）,从全血中分离出血浆,一部分血浆用于检测研究对象的病毒载量信息,另外一部分用于提取HIV-1病毒核酸。利用Prime 5.0软件设计针对HIV-1 B’亚型Nef基因的特异性引物,巢氏PCR扩增Nef全长,用双向引物对扩增产物双向重叠测序。测序结果用sequencher软件进行拼接、手工判读混合碱基,Bioed it软件进行手工调整后利用HIV sequence database 中 gene cutter在线工具进行序列比对。利用在线工具PHYML对比对好的序列构建最大似然树（ML tree）, HIV sequence database中entropy计算Nef蛋白各氨基酸位点的熵值；统计分析研究对象HLA-Ⅰ等位基因的频率和连锁不平衡单体型。利用进化校正的Logistic回归分析方法鉴定研究对象Nef蛋白HLA-I类分子介导的免疫逃逸突变位点,逃逸突变位点分两种类型：阳性相关（positive correlation）,指特定的氨基酸的出现与特定的HLA-Ⅰ等位基因的存在相关,阴性相关（negative correlation）,指特定氨基酸的缺失与特定的HLA-Ⅰ存在相关,反之亦然。阳性相关又称为"adapted form’’或者“escape form’’；阴性相关又被称为“nonadapted form"或者"susceptibleform”。统计分析逃逸突变位点的分布和变异规律,并分析其与临床指标的相关性。研究结果（1）在中低分辨率（二分类）水平上,本研究对象中一共检出52种HLAⅠ类（A、B、Cw）等位基因,13种两位点连锁不平衡单体型和2种三位点连锁不平衡单体型。其中,HLA-A*02/A*11/A*24/A*30; HLA-B*13/B*40/B*51; HLA-Cw*03/Cw*06/Cw*08是本研究对象中分布频率较高的等位基因,HLA-A*30/B*13, HLA-A*30/Cw*06, HLA-B*30/Cw*06是最常见的两位点连锁不平衡单体型；HLA-A*30/B*13/Cw*06是分布频率最高的三位点连锁不平衡单体型。（2）利用进化校正的Logistic回归分析在p<0.023,q<0.05的水平上一共鉴定得到137个HLA-APs,分布在62个氨基酸位点上,占Nef氨基酸位点总数的45%。阳性相关HLA-APs与阴性相关逃逸突变位点数量相当。HLA-APs发生在已知CTL表位内的频率（51.09%）和表位外的频率（48.91%）相近。Nef蛋白三个结构域的HLA-APs总数占各结构域氨基酸位点总数比例大小为：N端结构域（43.08%）>C端结构域（25.86%）>中间核心结构域（16.87%）。三个结构域HLA-APs位点的熵值均高于非HLA-APs位点的熵值。（3） HLA-APs类型主要分为三种,第一：大部分HLA-APs与多个HLAⅠ等位基因相关,但相关关系不同：第二：不同的HLAⅠ等位基因可以选择相同的逃逸突变,但选择的强度不同；第三：同一个突变氨基酸对于一种HLA来说是阳性相关关系,而对于另一种HLA则是阴性相关关系。在所有鉴定的HLA-APs中,16%类型与IHAC队列里的一致,但选择压力强度不同,35%未在IHAC队列里报道的与中国人群常见的HLA-Ⅰ等位基因相关。（4）9肽表位锚着位点逃逸频率最高,表位上游第二位氨基酸逃逸频率最低；8,10,11肽表位锚着位点第二位逃逸频率高,非锚着位点倒数第二位逃逸频率较低,且锚着位点的选择压力强度高于表位旁序列；9肽表位和8,10,11-肽表位锚着位点发生逃逸突变后可分别降低与HLA结合亲和力5.03和2.17倍。（5）在显著性检验水平α=1的水平上,阳性相关的HLA-APs分别与CD4+T细胞计数正相关（p=0.033,r=0.195）,与血浆病毒载量负相关（p=0.079,r=-0.164）。45S,163S,和196R三个阳性相关多态性位点分别与CD4 T细胞呈正相关（5S：p=0.0152；163S：p=0.04；196R：p=0.0298）和病毒载量呈负相关（45S：p=-0.0002；163S；p=-0.0005；196R：p<0.0001）；且这3个位点均与HLA-B*13等位基因相关。研究结论本研究在163条HIV-1 B’亚型毒株Nef蛋白序列上鉴定得到了137个HLA-APs,分布在Nef蛋白62个氨基酸残基上,阳性相关和阴性相关的逃逸突变位点数量相当。HLA-APs熵值显著高于非HLA-APs,提示HLA Ⅰ类分子介导的选择压力是驱动HIV-1序列多样性的原因之一。HLA-APs主要包括三种不同的类型,同一亚型不同种族间相同的HLA Ⅰ类分子介导的相同类型的逃逸突变选择强度不同。HLA-APs更倾向于发生在CTL表位的锚着位点,锚着位点发生逃逸突变后对HLA Ⅰ类分子结合的亲和力影响更为显著。H1V-1发生逃逸突变后可引起病毒复制能力降低,45S,163S,196R三个位点的逃逸突变可能与病毒适应性损伤有关。