论文部分内容阅读
石蒜属植物在我国资源丰富，天然分布最多且最广。石蒜属植物因其丰富的花色、花型，被誉为“中国的郁金香”，其观赏价值在园林和园艺上有重要的意义。换锦花的花色具有特殊性，即紫红色的花瓣以及花瓣尖端带有蓝色，为研究换锦花特殊的颜色形成机理，本研究以换锦花的花瓣为材料，通过RT-PCR和RACE技术相结合的方法获得换锦花花色形成相关的LsF3’H基因和LsMYB4基因，同时利用分子生物和生物信息学的方法分析其核苷酸序列以及编码的氨基酸序列，并利用荧光定量PCR技术对换锦花在花发育不同时期、不同组织器官以及花色存在差异不同无性系中的表达模式，来分析这些基因在换锦花花色形成中的功能和作用；通过构建过表达载体，利用异源转化的方法进一步验证和分析研究LsF3’H基因和LsMYB4基因对换锦花花色素苷生物合成的作用。主要的研究结果如下：（1）通过NCBI搜索同源基因，并设计简并引物克隆到换锦花LsF3’H基因和LsMYB基因片段；并结合RACE技术获得长1587bp的LsF3’H基因和793bp的LsMYB4基因cDNA全长序列；对其进行生物信息学分析结果表明LsF3’H具细胞色素P450的特异结构域，LsMYB4具有R2R3-MYB高度保守的特异结构，并对其蛋白质结构进行预测，在多序列比对的基础上，构建了系统进化树，对其进化关系进行分析，其分类和植物分类学基本一致，得出LsF3’H属于CYP75亚家族，LsMYB4和拟南芥亚群AtMYB4相似度最高。（2）利用荧光定量PCR分析换锦花中的LsF3’H和LsMYB4基因的表达，结果表明，LsF3’H和LsMYB4基因的表达均具有组织特异性，LsF3’H基因在不同组织和不同花发育时期均有表达，而且在花瓣中的相对表达量比叶多10倍，在盛花期的相对表达量比花苞期高70倍。在换锦花不同花色的无性系中表达存在差异，花色较浅的换锦花无性系相对表达量高于其它无性系；LsMYB4花瓣中的相对表达量比叶多9-10倍，在盛花期的相对表达量比花苞期多20倍。不同花色的无性系中表达存在差异，花色较浅的换锦花无性系相对表达量高于其它无性系，可以推测LsMYB4基因在调控换锦花花色形成的过程中起着负调控的作用。（3）通过双酶切的方法构建LsF3’H和LsMYB4基因的过表达载体，并利用农杆菌介导法进行烟草转化，共获得转基因阳性植株19株，并通过PCR进一步验证，表明烟草植株确定为转基因LsF3’H和LsMYB4基因的烟草，但对于LsF3’H和LsMYB4基因的过表达对烟草的花色素苷合成的影响和作用有待进一步研究。