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目的:糖尿病肾病(DN)是2型糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一,已成为终末期肾功能衰竭的首要原因。寻找针对DN的新治疗策略和提高其防治水平迫在眉睫。肾小球硬化是DN的典型特征,而肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质蛋白(ECM)过度生成是DN肾小球硬化的始动机制。因此,有效抑制肾小球系膜细胞的增殖和减少ECM的产生对防治DN肾小球硬化具有重要意义。雷公藤甲素是雷公藤药材及其制剂的主要有效成分,且其相关效价比雷公藤总苷高100~200倍,然而此药对DN的作用及机制尚未阐明。本研究以STZ/HFD诱导的SD糖尿病大鼠和人肾小球系膜细胞(HRMCs)为研究对象,通过体内动物实验和体外细胞实验两方面相互验证,旨在探讨:1.雷公藤甲素对STZ/HFD诱导的SD大鼠糖尿病肾小球硬化的作用及安全性;2.雷公藤甲素对糖尿病肾小球系膜细胞增殖的作用及机制;3.雷公藤甲素对糖尿病肾小球系膜细胞ECM积聚的作用及机制。方法:1.以STZ/HFD诱导的SD糖尿病大鼠为研究对象,按照随机数字表法将其分为正常对照组(NC)、糖尿病组(DM)和雷公藤甲素干预组(DM+TP)。在雷公藤甲素干预12周后,通过生化法检测大鼠肾脏功能、肝脏功能、24h尿微量白蛋白,评估对大鼠糖尿病肾病的改善作用及安全性。采用HE染色及PAS染色观察大鼠肾脏组织形态学变化,评估对大鼠肾小球硬化的干预效果;应用免疫组织化学及western blot法观察对糖尿病肾脏:细胞增殖及相关调节因子的影响;ECM积聚及相关调节因子的作用。应用qRT-PCR观察雷公藤甲素对各组大鼠肾脏组织microRNA水平的影响。2.以HRMCs为研究对象,给予雷公藤甲素干预后,通过western blot和免疫荧光法检测HRMCs中增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki67的表达,并通过流式细胞仪检测细胞周期、MTT法检测细胞增殖水平;此外通过western blot法检测雷公藤甲素对细胞增殖关键通路PDK1/Akt/mTOR信号通路的作用,向雷公藤甲素干预的系膜细胞中加入PDK1通路激活剂PS48,验证PDK1是否介导了雷公藤甲素抑制肾小球系膜细胞增殖的作用。3.以HRMCs为研究对象,通过western blot和免疫荧光法检测雷公藤甲素对HRMCs中ECM积聚的作用。通过基因芯片筛选高糖干预下明显变化的miRNA,并应用定量PCR进行验证;通过靶基因预测软件结合荧光素酶活性检测验证miRNA作用的靶基因,并通过细胞转染miRNA mimics或inhibitor进行功能获得性和功能缺失性研究,以探讨miRNA在糖尿病肾病中的可能作用及相关机制。Notch1通路可能与肾小球硬化的发生密切相关。通过向细胞转染Notch1的小干扰RNA(siRNA)和使用Notch1通路抑制剂DAPT,探讨Notch1在糖尿病肾小球硬化中的可能作用机制。通过向雷公藤甲素干预的系膜细胞中转染miRNA inhibitor,从基因水平探讨该miRNA是否介导了雷公藤甲素对高糖诱导下肾小球硬化的保护作用。结果:一、雷公藤甲素干预对STZ/HFD诱导的SD大鼠糖尿病肾小球硬化的作用;1.DM组大鼠糖尿病大鼠空腹血糖水平明显高于NC组正常大鼠,同时体重明显低于NC组正常大鼠。DM组大鼠24h尿微量白蛋白水平较NC组明显升高(P<0.05),肾小球基底膜增厚,系膜基质增多,肾小球硬化指数升高(P<0.05)。2.雷公藤甲素干预效果:雷公藤甲素对DM组大鼠血糖和体重无明显影响(P>0.05),可降低DM组大鼠肾重/体重比(P<0.05),降低其24h尿微量白蛋白水平(P<0.05),改善其肾脏形态,降低大鼠系膜基质表达和肾小球硬化指数(P<0.05)。3.雷公藤甲素对DM组大鼠肝、肾功能均未见影响(均P>0.05)。二、雷公藤甲素干预对糖尿病肾小球系膜细胞增殖的作用及机制;1.雷公藤甲素可明显抑制DM组大鼠肾组织和高糖(HG)干预的HRMCs中升高的增殖因子Ki-67和PCNA表达水平(P<0.05)。2.雷公藤甲素可明显抑制HG刺激的HRMCs数目增多;雷公藤甲素组G0/G1期比例(55.4±3.1)明显高于高糖组(40.4±2.1)(P<0.05),S期细胞比例(37.9±2.6)低于高糖组(41.5±3.6)(P<0.05),G2/M期细胞比例(5.7±1.2)低于高糖组(18.0±1.9)(P<0.05)。3.雷公藤甲素可明显抑制DM组大鼠肾组织和HG干预的HRMCs中激活的PDK1蛋白水平,抑制Akt和mTOR蛋白磷酸化水平(P<0.05)。4.向雷公藤甲素干预的系膜细胞中加入PDK1通路激活剂PS48后,PS48可降低雷公藤甲素对HRMCs细胞增殖的抑制作用(P<0.05);可降低雷公藤甲素对G0/G1期细胞比例的升高作用(P<0.05),抵消其对S期和G2/M期细胞比例的抑制作用;可降低雷公藤甲素对Ki-67和PCNA的抑制作用(P<0.05);降低雷公藤甲素对PDK1/Akt/mTOR信号通路的抑制作用(P<0.05)。三、雷公藤甲素干预对糖尿病肾小球系膜细胞ECM积聚的作用及机制;1.雷公藤甲素可明显抑制DM组大鼠肾组织和HG干预的HRMCs中升高的ECM蛋白Col IV和FN的表达水平(P<0.05)。2.雷公藤甲素可明显抑制DM组大鼠肾组织和HG干预的HRMCs中激活的Notch1表达,并可抑制Notch1下游蛋白Nicd、Hes1和Hey1的表达(P<0.05)。3.Notch1通路抑制剂DAPT和Notch1-siRNA均可抑制HG导致的HRMCs中Col IV和FN表达(P<0.05)。4.miRNA芯片筛选发现HG可导致HRMCs中的miR-137表达显著下调(P<0.05);qRT-PCR检测发现DM组大鼠肾组织和HG干预的HRMCs中miR-137表达下调,而雷公藤甲素可在一定程度上恢复其表达(P<0.05)。5.miR-137 mimics可降低HG诱导的HRMCs中ECM蛋白积聚和Notch1通路激活(P<0.05),miR-137 inhibitor可升高HRMCs中ECM和Notch1通路蛋白表达(P<0.05);双荧光素酶报告实验证明miR-137可与Notch1的3’-UTR区直接结合。6.miR-137 inhibitor可逆转雷公藤甲素对HRMC中ECM蛋白的抑制作用(P<0.05);可逆转雷公藤甲素对HRMC中Notch1通路的抑制作用(P<0.05)。结论:1.雷公藤甲素可通过改善糖尿病大鼠肾小球硬化,降低其24小时尿微量白蛋白水平,且独立于降糖作用。2.雷公藤甲素可能通过抑制PDK1/Akt/mTOR通路从而抑制糖尿病肾脏系膜细胞增殖,进而改善糖尿病肾小球硬化。3.雷公藤甲素可能通过上调miR-137水平而抑制Notch1通路的表达,进而抑制高血糖状态下的系膜细胞中ECM蛋白积聚,从而改善糖尿病肾小球硬化。