挖掘与鉴定影响奶牛产奶性状的关键基因是改善牛奶品质的关键步骤。课题组前期基于转录组测序确定DNA损伤诱导转录因子3（DNA damage induced transcript 3,DDIT3）（p=4.01E-05）为奶牛产奶性状重要的候选基因。因此,本研究首先通过大群验证对DDIT3进行遗传效应分析,进一步通过DDIT3干扰实验验证其功能,结果如下:（1）遗传效应分析:通过混池测序检测DDIT3的多态性,在启动子区发现2个SNPs位点,进一步与中国荷斯坦牛的5个产奶性状（产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率）进行关联分析,确定SNP位点的遗传效应。发现DDIT3基因2个位点均与乳脂性状极显著关联（p=0.0001;p=0.0006）,与产奶量关联显著（p=0.0063）,且这2个SNPs完全连锁。（2）干扰片段筛选:首先利用Crispr-CAS9成功构建了p GBCas9-2A-puro-2A-GFP载体,通过脂质体转染奶牛乳腺上皮细胞,但转染效率非常低,故进一步实验采用慢病毒干扰技术对DDIT3基因进行干扰。通过设计合成sh RNA,连接至慢病毒载体质粒LV3（H1/GFP&Puro）,构建DDIT3基因的重组慢病毒干扰载体,转化后提取质粒通过酶切和测序进行阳性克隆的鉴定。将鉴定正确的重组慢病毒载体质粒分别与包装质粒（p Gag/Pol、p Rev、p VSV-G）共转染293T细胞,获得的重组慢病毒,将DDIT3慢病毒sh RNA干扰载体感染奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）,成功获得DDIT3基因的慢病毒重组干扰载体DDIT3-LV3-D287（干扰效率60%）。（3）DDIT3基因的功能验证:将阴性对照组与DDIT3-LV3-D287实验组转染MAC-T细胞,72h后提取总RNA,基于RNA-seq筛选出显著差异基因3838个,其中包含1989个上调基因,1949个下调基因,并对筛选的差异基因并进行GO和Pathway富集分析,富集结果显示DDIT3基因主要影响细胞的增殖、细胞凋亡、免疫炎症方面的相关通路。同时,与脂质代谢相关的基因SCD、ELOVL6、ACSL6等基因在不同处理组显著差异性表达（p<0.001）。因此,DDIT3基因可能通过影响脂质代谢相关基因的表达及介导细胞免疫、凋亡等进一步调控奶牛的产奶性状。