论文部分内容阅读
高致病性禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒H5N1引起的烈性传染病。近年来随着疾病的不断蔓延,禽流感病毒不仅使各地养禽业蒙受巨大损失,而且还不断突破种间屏障引发人感染事件。目前高致病性禽流感面临的问题是病死率居高不下且缺乏有效的治疗药物。由于流感病毒的持续快速变异,自然界中H5N1病毒已逐渐形成多种抗原性不同的变异亚系病毒株共流行的状况,要满足长期战略储备药物的需求,研制的H5N1治疗药物必须具备广谱性。中和单抗是防治病毒性疾病的一种有效手段,但由于禽流感病毒基因突变频率高,特别是血凝素(HA)基因,因此针对禽流感病毒的中和单抗中和谱较窄,往往只能中和少数遗传变异亚系的病毒,极大限制了这些中和单抗的应用。基于本实验室近期构建的一个具有血凝抑制(AI)活性的H5特异性单克隆抗体库(已经用41株包含全部10个遗传进化分支的H5N1病毒代表株对这些单抗的HI活性和以小鼠为动物模型的中和活性进行了测定),本研究选取四株广谱中和活性强的鼠单抗:4D1、10F7、8H5、13D4进行人源化改造,以降低鼠抗在人治疗过程中的HAMA反应,为这些抗体尽快进入临床应用奠定基础;同时也希望建立一套治疗性抗体人源化研究的平台体系,包括基因的改造、表达载体的构建、哺乳动物细胞高效稳定表达、无血清大规模培养、抗体纯化工艺等。本研究先以RT-PCR的方式从鼠杂交瘤细胞内获得四株抗体的可变区基因,再结合至人抗体IgG1的恒定区,插入pcDNA3.1表达载体瞬时表达得到嵌合抗体产物;通过HI、ELISA、免疫荧光方法验证抗体具有活性。为了在短期内累积一定的产物用于后续研究,我们选用FLP-IN定点整合表达系统,其FRT定点整合的特点使抗体能够稳定高效表达,经过细胞筛选流程,我们现已获得三株稳定表达细胞株,而且抗体的表达产量提高了3-4倍。在获得少量无血清培养的抗体纯化物后,我们用多株H5N1病毒株HI实验、及细胞体外中和实验验证嵌合抗体的广谱中和活性,以确定整个改造及表达过程中抗体的可变区活性没有受到影响。本研究选择13D4嵌合抗体进行大规模表达和纯化。为了满足下游抗体纯化简便及大规模生产的需求,我们对CHO细胞的无血清培养方法也进行了探索,包括优化无血清培养基的营养成分、滚瓶较大规模培养操作等。我们发现BSA添加物确实可以显著提高嵌合抗体的产量,尤其是3%的添加比例,可使抗体产量提高8倍,但与此同时给抗体的纯化带来干扰,应该综合考虑抗体的纯度和得率来决定最优方案;蛋白A亲和层析法一直是抗体纯化的特异有效方式,我们摸索了不同洗脱PH缓冲液,得到适合嵌合抗体纯化的洗脱PH值,最终纯度达到95%,得率在90%。针对具有代表性的四株H5N1病毒的动物保护实验结果证明,在Vietnam/1194/2005感染后的第1和3天,以及在BH Goose/Qinghai/15c/2005和Shenzhen/406H/2006感染后的第1天,13D4嵌合抗体均有100%的治疗效果。而在Indonesia/5/2005感染后的第1天和Shenzhen/406H/2006感染后的第3天,13D4嵌合抗体的治疗效果欠佳。总之,通过以上方法我们成功构建了四株高致病性禽流感H5N1人-鼠嵌合抗体,它们保留了亲本鼠抗的广谱中和活性,将降低治疗人感染疾病时的HAMA反应,为治疗性抗体在人感染H5N1领域的应用奠定了基础。