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本文对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)不同时期的大鼠正中隆起(ME)进行动态形态学观察,探讨该室周器官在机体不同免疫状态下的变化。
研究方法:选择健康Wistar雌性大鼠72只,体重180-200g,主动诱导制备EAE模型,在免疫后6小时,7天,14天和21天(分别为柔膜反应期组、潜伏期组、发病极期组、恢复期组),对ME进行HE染色、TUNEL技术检测凋亡细胞、扫描电镜、透射电镜观察。
1.EAE模型制备:用豚鼠脊髓匀浆加完全福氏佐剂,主动免疫Wistar雌性大鼠,在免疫后6小时(柔膜反应期),7天(潜伏期),14天(发病极期),21天(恢复期)四个时间点,常规经心灌注固定,取脑,分别以HE和TUNEL技术检测凋亡细胞,扫描电镜,透射电镜,观察ME形态学变化。
2.光镜标本制备:常规经心灌注,固定,取脑,冠状方向去除视交叉以前和漏斗柄以后部分,留取中间部分脑块后固定24小时,然后在磷酸缓冲液(0.1M,pH7.2)中冲洗三次,每次6小时,再用梯度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋,修块,用Leica石蜡切片机连续切片,片厚5m。常规HE染色,脱水,透明,封片。显微镜观察,OLYMPUS万能显微镜照相。
3.扫描电镜样品制备:麻醉、灌注方法同光镜标本制备,但灌注液为1.5%的多聚甲醛和2.5%戊二醛磷酸缓冲液(0.1M,pH7.2)灌注完毕取材:将脑腹面朝上,在视交叉两侧各1mm平行做两道矢状切口向后延伸至漏斗柄,在漏斗柄后做一冠状切口,在距离脑底面3mm处做一平行切口,所取下的脑块即含ME,观察时腹面朝下,上面的小凹即为脑室面,视交叉为前,漏斗柄为后。将取下ME用PB冲洗后置于2.5%戊二醛(4℃)中。双蒸水冲洗,梯度酒精脱水,叔丁醇置换,二氧化碳临界点干燥。真空喷金。日立S-3500N扫描电镜观察,照相。
4.透射电镜样品制备:取材过程同扫描电镜样品制备,在灌注固定后,取ME组织块放入4%戊二醛中固定,1%锇酸固定1h,Epon812包埋,LKB-V型超薄切片机切片,T-7500N型透射电镜观察照相。
5.TUNEL实验组样品制备:动物的麻醉、灌注、取材和后固定、石蜡切片同光镜标本制备,常规脱蜡、入水,蛋白酶K消化,0.3%H2O2甲醇液封闭,冰上透化后加上TUNEL反应液,POD转化,DAB显色。HE复染,常规脱水、透明、封片。OLYMPUS万能显微镜观察并照相。
6.凋亡细胞评价标准及统计学处理:显微镜下观察,以胞核固缩,深棕黄色的细胞为阳性染色。随机选取5个不重叠视野,采用自动免疫组化分析系统Version2.0记录阳性细胞数。采用单因素方差分析,有显著差异者用q检验进行两两比较,以p<0.05为有显著差异。
研究结果:
1.光镜观察结果:HE染色,对照组ME室管膜细胞呈单层柱状排列,EAE潜伏期、发病极期,室管膜细胞排列密集,呈双层或复层排列,以发病极期最明显。柔膜反应期和恢复期接近于对照组。室管膜细胞排列的密集程度,测量每50×50μm2细胞数,发病极期>潜伏期>柔膜反应期和恢复期。
2.扫描电镜观察结果:对照组ME处少纤毛区可见丰富的分泌颗粒,大小均匀,表面光滑,直径0.2-3.0μm。实验组ME表面的分泌颗粒形态、分布形式、大小出现明显变化,在柔膜反应期大的分泌颗粒(直径约1.0-1.5μm)减少,小的分泌颗粒(直径约0.3μm)增多,排列更加稠密;潜伏期时分泌颗粒以大的为主,排列稀疏;发病极期时ME表面分泌颗粒减少,相互粘连似葡萄状,室管膜上可见大量吞噬细胞样细胞附着,于这些细胞上还可见到正在形成的分泌颗粒;恢复期室管膜表面分泌颗粒基本正常,有的部位相互粘连成团状或条索状,仍可见到散在吞噬细胞样细胞。
3.透射电镜观察结果:EAE大鼠免疫后6小时,柔膜反应期时,可见室管膜细胞内大量细胞器聚集于细胞的游离缘,线粒体密集,室管膜下层细胞出现胞质肿胀,充满水肿空泡,直径约400-600nm,在血管周围可见丰富的线粒体聚集现象。潜伏期时,室管膜细胞不同的分泌现象在该处皆可见到。有的分泌颗粒呈球形,直径约5.0μm,与室管膜细胞脱离;有的分泌颗粒呈蘑菇状,部分与室管膜细胞相连,无胞膜,内含许多有膜囊泡,结构松散。于发病极期可见室管膜细胞向外凸起,形成较大的分泌颗粒,长椭圆形,有胞膜,最大径约2.5μm,未见空泡,均质状,较致密,细胞内有溶酶体吞噬现象;于室管膜上可见较多的直径为250-400nm的分泌颗粒。在恢复期室管膜细胞表面也可见到分泌颗粒,但形态不规则,最大径3.5μm,内含多种囊泡,约50个,大小不等,圆形、椭圆形;紧贴于室管膜细胞下层,可见电子密度高的细胞,胞质浓缩,细胞核皱缩,折曲,可能是小胶质细胞。
4.TUNEL实验组观察结果:对照组仅见个别凋亡细胞。计数50×50μm2范围内凋亡细胞数(X±S)。潜伏期:16.6±2.07;发病极期:21.2±1.92;恢复期:5±1.00。经方差分析、q检验(P<0.05)有显著性差异。发病极期>潜伏期>恢复期>对照组。
研究结论:本研究首次用光镜,扫描电镜,透射电镜,TUNEL技术检测凋亡细胞,对EAE大鼠不同病程的ME进行了系统观察:
1.HE染色EAE各期室管膜细胞排列的密集程度,发病极期>潜伏期>柔膜反应期和恢复期。
2.在EAE模型上用扫描电镜首次发现在柔膜反应期时ME的室管膜细胞分泌颗粒细小稠密;潜伏期数目减少,呈小堆状分布;发病极期时分泌颗粒稀少,可见室管膜上有大量吞噬细胞样细胞,而恢复期室管膜结构恢复正常。
3.用透射电镜也观察到ME室管膜细胞不同形态的分泌颗粒。
4.ME中的细胞凋亡数在EAE不同发病时期有明显差异,发病极期>潜伏期>恢复期>对照组。