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牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)是熊胆粉的主要及特有活性成分。基于重大新药创制项目“体外培育熊胆粉关键技术及临床前研究”2014ZX09301306-007的科研项目,课题组前期采用戊二醛活化的壳聚糖微球为载体,将牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)在体外催化转化为TUDCA的关键酶,即7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-hydroxysteroid dehydrogenase,7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hydroxysteroid dehydrogenase,7β-HSDH)进行固定化,以解决游离酶不利于工业生产的问题。但在连续反应操作的过程中,大量壳聚糖微球因其较差的机械强度而发生破裂,难以满足产业化的需求。因此选择新的性能优良且机械强度高的固定化酶载体是本课题的主要出发点。环氧基树脂因其较高的机械强度,良好的物理及化学性能,而被广泛用作固定化酶的载体材料。但由于环氧基树脂得到的固定化酶存在酶活较低的情况,因此本课题对环氧基树脂进行了氨基修饰,得到具有双官能团的氨基-环氧基树脂,并以此作为载体材料,进行7α-HSDH和7β-HSDH的固定化研究,并进一步研究了双酶共固定体系对TCDCA的转化。以EDA修饰环氧基树脂得到的氨基-环氧基树脂为载体,进行7α-HSDH和7β-HSDH的固定化,载体的机械强度较高,且得到的固定化酶的酶活较高、连续操作性强、稳定性好,利于产业化生产。本文的主要研究内容如下:(1)氨基-环氧基树脂的制备与表征。以环氧基树脂为载体,采用乙二胺(EDA)修饰的方法对环氧基树脂进行氨基化修饰,并通过红外光谱的方法验证了氨基-环氧基团的成功引入,获得具有双官能基团的氨基-环氧基树脂。扫描电镜结果显示修饰前后载体的形态未发生明显改变;用滴定法测定氨基修饰密度,在6 h时达到修饰平衡;Zeta电位表明在pH 2~10范围内,载体表面带正电荷;氨基修饰后,接触角由51.5°减小至33.4°,表明载体的亲水性增强,疏水性减弱。(2)7α-HSDH和7β-HSDH固定化工艺的建立。以氨基修饰密度为67.6μmol/g的氨基-环氧基树脂固定化7α-HSDH和7β-HSDH,酶活可达到最高值。在相同的固定化条件下,与环氧基树脂固定化酶相比,用氨基-环氧基树脂(修饰密度为67.6μmol/g)固定化7α-HSDH和7β-HSDH,酶活分别提高了5.8倍和1.25倍。不同载体固定得到的固定化酶固定率及酶活的差异,主要是由于两种载体的固定化原理不同所致。在此基础上,进一步优化确定了氨基-环氧基树脂固定化酶的条件:7α-HSDH和7β-HSDH的最佳固定化时间分别为4 h和3 h;最佳固定化温度均为15°C;最佳固定化pH均为7.5。在此固定化条件下,可得到酶活较高的固定化酶。(3)固定化酶的酶学性质的研究。固定化7α-HSDH和7β-HSDH的最适反应温度分别为20°C和25°C;固定化7α-HSDH和7β-HSDH的最适p H分别为10和5.5。对比固定前后米氏常数Km值的变化,发现固定后7α-HSDH对TCDCA和NADP+的亲和力减小;而7β-HSDH对T-7-KLCA的亲和力增加,对NADPH的亲和力减小。通过与游离酶的比较发现,固定化酶的热稳定性明显提高。当温度达到35°C时,游离7α-HSDH和7β-HSDH的保留酶活分别还剩50.67%和58%,而固定化酶在此温度下的保留酶活分别约为73.52%和84.08%。固定化7α-HSDH和7β-HSDH连续催化转化6次,其剩余酶活分别为79.4%和83.1%,具有较好的操作稳定性;将固定化7α-HSDH和7β-HSDH在pH 8.0、4°C条件下贮藏4周后,剩余酶活分别为49.1%和66.4%,具有较好的贮藏稳定性。(4)7α-HSDH和7β-HSDH的双酶共固定研究。采用先固定7β-HSDH,再固定7α-HSDH的方式,在25°C,pH 8.0的催化条件下,TUDCA的产率可达到31.57%;当7α-HSDH与7β-HSDH两酶的比例为3:1,可获得较高产率的TUDCA,为34.3%。在双酶联合酶促催化反应体系中,当底物TCDCA的浓度为6 mM,TUDCA的产率达到最高,而当TCDCA的浓度高于6 mM时,则出现了底物抑制现象。双酶联合转化实现了辅酶NADP+的循环利用,且当NADP+的浓度为2 mM时,更有利于TCDCA转化为TUDCA。