在众多仔猪腹泻病当中,细菌性腹泻病在猪场尤为常见。大肠杆菌对哺乳仔猪的影响较大,引起仔猪出现以急性腹泻、脱水和消瘦为特征的大肠杆菌病,该病传染性强,传播途径广,影响范围大且治疗手段有限,严重危害仔猪的生长和发育,已经成为猪场广泛关注的腹泻疾病。不同日龄仔猪感染不同的血清型大肠杆菌表现出不同的症状,目前所说的仔猪大肠杆菌病主要指的是仔猪黄痢、仔猪白痢、断奶仔猪腹泻以及断奶仔猪水肿病。目前常规的细菌病生物鉴别诊断方法费时费力,灵敏性和特异性不高,因此针对细菌的致病因子建立快速高效的检测方法对致病大肠杆菌做出准确诊断,从而实现疾病的早期发现和防控尤为重要。本研究首先建立了针对大肠杆菌F4、F5、F6菌毛基因、LT基因、Stx2e基因的五种单重荧光定量PCR检测方法。在NCBI上查找基因保守区域,设计5对特异性引物和Taq Man探针,优化退火温度和引物探针的浓度、建立标准曲线、评估各方法的敏感性、特异性和重复性。结果表明,五种单重方法的标准曲线相关系数R~2均大于0.990,线性关系良好。F4、F5、F6菌毛以及LT的最低检测量为10~1copies/μL,Stx2e的最低检测量为10~2copies/μL,比普通PCR敏感10倍至10~4倍。以链球菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌几种常见的猪致病菌作为对照菌株进行特异性试验,结果表明五种方法都只有阳性标准品出现了扩增信号,对照菌株无扩增信号。批内重复性试验变异系数都在3%以下,批间重复性试验变异系数都在4%以下,有较好的稳定性。在建立单重荧光定量PCR方法的基础上,建立一种能够在同一体系中同时检测F4、F5和F6三种菌毛基因的三重荧光定量PCR方法。对反应条件进行优化,建立标准曲线,结果显示相关系数R~2均大于0.980,线性关系良好。敏感性试验结果表明:F4菌毛的最低检测量为10~0copies/μL,F6菌毛的最低检测量为10~1copies/μL,均比普通PCR敏感100倍;F5菌毛的最低检测量为10~1copies/μL,比普通PCR敏感1000倍。特异性实验结果表明:三种菌毛阳性对照均产生扩增信号,对其他细菌无扩增曲线,表明特异性强。建立的三重荧光定量PCR方法批内和批间重复性试验的变异系数均在5%以下,具有良好的稳定性。用建立的五种单重荧光定量PCR方法和三重荧光定量PCR方法共检测了从猪场收集的88份样品,其中疑似猪水肿病样品59份,仔猪腹泻样品29份。结果显示,Stx2e阳性样品检出16份,LT阳性样品检出7份,F4菌毛阳性检出2份,F5和F6菌毛阳性未检出,单重和多重荧光定量PCR方法与普通PCR检测结果符合率高,可以有效的检测致病性大肠杆菌的五种毒力因子并用于临床样品的检测。综上所述,本研究成功的建立了致病性大肠杆菌F4、F5、F6菌毛基因、LT基因、Stx2e基因五种毒素基因的单重荧光定量PCR方法以及三种菌毛毒素的三重荧光定量PCR检测方法,特异性强、灵敏度高、稳定性好,为仔猪大肠杆菌病毒力因子的临床样品定量检测提供了技术手段。