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禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起禽大肠杆菌病,主要引起禽类呼吸道感染、心包炎和败血症。APEC有众多的毒力因子在致病过程中发挥重要作用。主要有黏附素、侵袭素、摄铁系统、荚膜、抗血清存活因子、二元调控系统、毒素等。ompR/envZ二元调控系统广泛存在于多种菌属中,其在细菌响应环境中的渗透压变化过程中发挥重要的调控作用,但其在APEC的致病过程中发挥的作用尚未见报道。本研究分别构建APEC O2血清型的envZ单基因缺失株和回复株以及ompR单基因缺失株和回复株,随后对基因缺失株进行生长曲线的测定、运动性的检测、生物被膜形成能力检测、环境耐受试验。通过进一步比较野生株和基因缺失株之间毒力因子的转录水平和对鸡体致病力的研究,揭示Omp R/Env Z二元调控系统与APEC致病性之间的调控机制。研究内容及结果如下:1.envZ基因缺失对APEC生物学特性及致病力的影响本实验利用Red同源重组技术对envZ基因进行缺失,成功构建envZ单基因缺失株AE17ΔenvZ。使用低拷贝质粒p STV28成功构建envZ基因回复株AE17C-envZ。通过生物学特性实验发现envZ基因缺失并不影响其在LB液体培养基中的生长性能(p>0.05),但使其运动性能力显著增强(p<0.05);生物被膜形成能力显著下降(p<0.05);扫描电镜观察发现相较于野生株AE17生物被膜较厚,菌与菌之间的连接紧密,AE17ΔenvZ缺失株生物被膜比较薄,菌与菌之间分布相对松散,与野生株相比,envZ缺失株对p H=10的碱性环境的耐受力较野生株极显著降低(p<0.01),对p H=5的酸性环境抵抗力较野生株显著降低(p<0.05);对50%血清环境的抵抗力显著降低(p<0.05)。LD50测结果则显示,envZ缺失后对7日龄罗曼鸡的致病力下降7.50倍。2.envZ缺失株差异表达基因的研究本试验通过RNA-Seq技术探索envZ缺失对APEC基因水平的影响,结果从转录组数据中筛选出envZ缺失引起的差异表达基因有711个,包括上调303个和下调408个,其中包括调控鞭毛、生物被膜、外膜蛋白以及二元调控系统等表达的差异基因。通过将差异基因注释到GO数据库中发现,共有269个差异基因参与到GO功能分类,得到1163个GO功能注释,主要涉及脂肪酸代谢过程等生物学过程和离子结合等分子功能方面,在细胞组分方面,显著性GO功能涉及ATP结合(ABC)转运蛋白复合物、外膜等。KEGG功能分析发现被注释的差异基因有661个,涉及到78个信号通路。主要涉及代谢途径、不同环境中的微生物代谢、氨基酸的生物合成、两组分系统、鞭毛组装、生物被膜形成等通路。3.ompR基因缺失对APEC生物学特性及致病力的影响利用CRISPR-Cas9编辑技术对ompR基因进行缺失,成功构建ompR单基因缺失株AE17ΔompR并使用低拷贝质粒p STV28成功构建ompR基因回复株AE17C-ompR。随后通过一系列的实验来探索ompR基因缺失株对APEC生物学特性的影响。结果发现ompR基因缺失并不影响其在LB液体培养基中的生长(p>0.05),但ompR基因的缺失使AE17的运动性能力极显著下降(p<0.01),透射电镜观察到ompR缺失后使得野生株的鞭毛数量变少。与野生株相比,ompR缺失使生物被膜形成能力极显著降低(p<0.01)。生物被膜扫描电镜观察发现对比野生株AE17生物被膜的较厚以及菌与菌的连接紧密,ompR缺失株形成的生物被膜则比较薄并且菌体之间的连接则相对松散。与野生株相比,ompR缺失株对p H=10的碱性环境耐受力极显著降低(p<0.01);对p H=5的酸性环境的耐受力较野生株显著降低(p<0.05);对50%血清环境的耐受力较野生株极显著降低(p<0.01)。半数致死量检测结果显示,ompR缺失株对鸡的致病力下降74.98倍。通过荧光定量PCR检测相关毒力基因的表达水平发现flh D、fli N、ycg R、dks A、glg C、iss、tsh毒力基因均出现不同程度的下调,而lux S毒力基因则出现了上调。综上所述,本研究成功构建了envZ和ompR单基因的缺失株及回复株,缺失envZ后使得其生物被膜形成能力、环境耐受能力、鸡的致病力均有不同程度的下降,但使其运动能力增强,通过envZ缺失株转录组数据筛选出包括调控鞭毛、生物被膜、外膜蛋白以及二元调控系统等表达的差异基因。缺失ompR后使得运动能力、生物被膜形成能力、耐碱性、耐酸性和耐血清杀菌能力以及对鸡的致病力均有不同程度的降低,荧光定量PCR检测flh D、fli N、ycg R、dks A、glg C、iss、tsh转录水平下调,而lux S毒力基因转录水平上调。结果表明envZ和ompR基因对APEC的致病力具有重要的影响,为后续研究APEC抵抗宿主先天性免疫防御机理奠定一定的研究基础。