恒定链（Invariant chain,Ii）,又名CD74,具有协助主要组织相容性复合体（the major histocompatibility complex,MHC）对抗原肽转运、促进B细胞成熟和作为细胞因子的受体等免疫学功能。Ii是由胞浆区（Cyt）、跨膜区（Tra）、内质网腔区组成,其中网腔区又由CLIP（ClassⅡ-associated invariant chain peptide）和三聚体区（Trim）组成。同时,Rab样蛋白（Ras-like protein,Rab）属于RAS相关的小GTP酶,在抗原提呈细胞中,Rab蛋白在调控细胞囊泡的形成、转运、融合的过程起到重要作用。研究发现以Ii或者Ii活性片段作为载体连接的抗原肽,可以靶向提呈抗原至内吞体中,易化抗原的转运过程。本课题对Ii及其活性片段在细胞中的转运进行研究。主要进行了以下三个方面内容:第一,明确Rab5a分子参与Ii在细胞早期内吞体的转运,这种转运作用与Ii的CLIP区相关。首先,用自行设计的引物克隆鸡Rab5a基因,构建含鸡c Ii、c Ii突变体(Ii_D81-87aa和Ii_D91-99aa)的重组表达载体。其次,应用软件比对鸡（Gallus gallus）和小鼠（Mus musculus）Rab5a蛋白质结构。最后,分别将Rab5a和Ii转染DC2.4细胞,应用免疫荧光和激光共聚焦观察鸡Rab5a与c Ii、c Ii_D81-87aa和c Ii_D91-99aa在真核细胞内的定位与共定位。应用pull-down和western-blot检测鸡Rab5a和Ii蛋白分子间的相互作用。结果表明,克隆获得的鸡Rab5a基因与预期大小一致,为648 bp。分子结构分析表明鸡与小鼠Rab5a高度相似,同源性高达95.4%。同源建模分析结果显示,鸡与小鼠Rab5a均含有5个α螺旋和6个β螺旋区,表明哺乳类和禽类Rab5a是同源的。激光共聚焦观察表明,鸡Rab5a和Ii均定位于细胞的早期内吞体,而突变体Ii _D81-87aa和Ii_D91-99aa却不能定位于早期内吞体。Pull-down和western-blot结果显示鸡Rab5a能够结合Ii分子。第二,明确Rab7b参与Ii在细胞晚期内吞体中的转运。首先,用自行设计的引物扩增鸡和鼠Rab7b基因,并进行氨基酸同源比对,同时构建含鸡Rab7b及67位氨基酸突变体Rab7b Q67L的原核和真核重组质粒。其次,分别将构建的带有红色荧光蛋白标记的重组质粒pm Cherry-C1-c Rab7b、pm Cherry-C1-c Rab7b Q67L、pm Cherry-C1-c Ii转染Raw264.7细胞并与小鼠的FITC标记的晚期内吞体蛋白1（LAMP1）进行细胞内共定位,用激光共聚焦显微镜观察Rab7b和Rab7b Q67L与Ii在细胞晚期内吞体内的共定位。最后用pull-down和western-blot检测鸡Rab7b和Rab7b Q67L与Ii的结合。结果表明,克隆获得的鸡Rab7b基因与预期大小一致,开放阅读框为624 bp,编码208个氨基酸。同源性比对结果表明鸡和鼠的Rab7b蛋白质结构同源性为74%;构建了Rab7b及其突变体Rab7b Q67L的原核和真核表达重组质粒,激光共聚焦结果表明,Rab7b和Ii可以共定位于晚期内吞体,而Rab7b Q67L不能;Pull-down和western-blot结果显示鸡Rab7b和Rab7b Q67L均能够与Ii分子结合。第三,明确Ii活性片段携带不同性质抗原肽分别与MHC I和II类分子在细胞内吞体中共定位。根据NCBI中登录的小鼠Ii基因序列设计Ii及其活性区域的基因序列设计引物扩增Ii_{（Cyt/Tra）}、Ii_{（Cyt/Tra/Clip）}和对照区域Ii_（Trim）,利用重叠延伸PCR分别构建含Ii这三个片段与T细胞表位(OVA_257-264)或B细胞表位(OVA_323-339)的重组真核质粒。将构建的重组质粒分别与MHC I或MHC II类分子共转染293T细胞,结果显示携带Ii（Cyt/Tra）/OVA257-264/Ii（Cyt/Tra）/OVA323-339、Ii（Cyt/Tra/Clip）/OVA257-264/Ii（Cyt/Tra/Clip）/OVA323-339均可以与MHC I和MHC II类分子共定位于内吞体中,而对照组Ii_（Trim）/OVA_257-264/Ii_（Trim）/OVA_323-339却不能。这说明以Ii为载体的抗原肽可以在细胞内参与抗原的交叉提呈。进一步共聚焦结果发现,Ii_{（Cyt/Tra）}/OVA_257-264/Ii_{（Cyt/Tra）}/OVA_323-339、Ii_{（Cyt/Tra/Clip）}/OVA_257-264/Ii_{（Cyt/Tra/Clip）}/OVA_323-339在细胞内吞体中可以与Rab5a共定位,这说明Rab5a参与了Ii活性区域在细胞内转运抗原肽。综上所述,Rab5a和Rab7b参与Ii在细胞内转运,以Ii为活性片段的载体可以携带不同性质抗原提靶向进入内吞体,这个过程与Rab分子的转运有关。这为进一步研究Ii及其活性片段在细胞内转运,阐述Ii载体的应用提供理论基础。