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青蒿琥酯(ART)是一种倍半萜结构的化合物,也是青蒿素的半合成衍生物之一,被认为是一种安全、高效的抗疟疾药物。大量研究表明,青蒿琥酯除具有很好的抗疟原虫活性外,还能抑制肿瘤细胞的增殖、调节免疫功能及对多种致炎因子诱导的巨噬细胞释放促炎因子有显著的抑制作用。但由于ART在水中几乎不溶,静脉注射后血药浓度下降很快,半衰期仅30min左右,生物利用度较低,稳定性差,因此目前临床应用仍受到限制。结肠癌被认为是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,2018年全球结肠癌新发病例约110万例,死亡551269人,对人类的生命健康构成了巨大挑战。目前,肿瘤的临床治疗手段主要有手术、化疗、放疗等。其中化疗被认为是结肠癌最常见的治疗方法之一,给患者带来了更多的生存收益。然而,由于非靶向抗癌药物对肿瘤部位的药物输送和对正常组织的严重毒副作用,化学治疗的预后往往不够理想,导致有限的治疗效果、肿瘤细胞产生耐药性及迁移到其他器官,从而限制了患者的5年生存率。基于上述问题,许多研究者开始尝试利用新型给药系统的优势,来改善青蒿琥酯的稳定性及生物利用度,进而提高药效如纳米粒子、脂质体、树枝状大分子、纳米胶束等。因此,本研究通过三嵌段聚合物材料聚2-乙基-(2-噁唑啉)-聚乳酸-聚-β-氨基酯(PEOz-PLA-PBAE)键合青蒿琥酯制备成具有pH响应的青蒿琥酯前药(PBAE-ART),并对其理化性质进行表征,通过研究体内外抗CT-26小鼠结肠癌活性,以期用于临床来辅助结肠癌的治疗,扩大ART在治疗疾病中的应用范围。材料合成中首先通过N-Boc-乙醇胺与对甲苯磺酰氯通过取代反应合成引发剂,通过过正相柱进行纯化得引发剂(Boc-OTs),2-乙基-2噁唑啉在Boc-OTs的引发下发生聚合反应得到聚2-乙基-2噁唑啉(PEOz),PEOz引发D,L-丙交酯通过开环聚合反应合成两嵌段聚合物PEOz-PLA,其端羟基经丙烯酰氯活化后加入2-氨基-1,3丙二醇(或6-氨基-1-己醇)与1,4-丁二醇二丙烯酸酯(或1,6-己二醇二丙烯酸酯、或1,9-壬二醇二丙烯酸酯)合成六种不同的三嵌段聚合物PEOz-PLA-PBAE。聚合物的表征:首先通过核磁氢谱(1H-NMR)来确认各聚合物的结构和分子量;其次,聚合物碱解离常数pKb通过酸碱滴定法来测定,考察聚合物是否具有pH响应行为;最后引入芘作荧光探针测定聚合物材料的临界胶束浓度(CMC)的大小。核磁氢谱数据表明各聚合物的结构符合预期结果,六种聚合物 PEOz-PLA-PBAE 分子量分别 7249Da,8293Da,7153Da,7782Da,6985Da,6596Da,pKb值均在6.5附近,说明聚合物具有一定的pH响应性,CMC分别为 2.37mg·L-1,2.38mg·L-1,1.79mg·L-1,2.05mg·L-1,5.01mg·L-1,1.74mg·L-1,说明各聚合物在较低浓度下均能自发形成胶束。前药的制备通过聚合物材料PBAE片段上的羟基与ART上的羧基反应,将ART通过化学键合在聚合物载体材料上,通过透析法制备前药胶束(PBAE-ART),利用激光粒度仪测定胶束的粒径及粒径分布,透射电镜观察胶束的结构与形态;采用高效液相色谱法对前药胶束的节枝率进行测定;通过测定胶束在不同pH条件下的粒径变化及电位变化考察胶束的响应性能;通过测定37℃条件下胶束粒度变化评价胶束稳定性;综上实验结果筛选出性能较好的前药胶束。采用透析法验证聚合物材料键合的ART的累计释放量是否受pH影响。结果显示:前药胶束粒度分布均匀,但各前药胶束的粒径差异比较大,与空白胶束粒度相比,ART前药胶束粒径具有一定程度的增加,增加程度与键合青蒿琥酯的数量有关,其原因是疏水端内核增加;不同前药胶束均具有一定的pH敏感性,在不同pH条件下各前药胶束的电位变化趋势一致;各前药胶束在37℃,96h内,粒径变化无显著性差异,稳定性较好;不同前药胶束的载药量差异也较大,其中PBAE片段二丙烯酸酯采用1,4-丁二醇二丙烯酸酯时,载药量较大但胶束粒径也较大,分别为5.31%±0.25%,190.31±4.5nm,9.57%±1.24%,197.25±6.4nm;PBAE片段二丙烯酸酯采用1,9-壬二醇二丙烯酸酯时,载药量较小但粒径小,分别为3.98%±0.59%,33.45±0.8nm,2.14%±1.08%,97.43±2.2nm;综上实验结果选用PBAE-ART4与PBAE-ART2两种前药开展后续实验研究。PBAE-ART4与PBAE-ART2在pH7.4和pH6.0两种条件下研究药物的释放性能,发现两种同一环境呈现相同的释放趋势,前药胶束在pH7.4条件下的48h的累计释放量分别为57.2%、55.9%,pH6.0条件下的48h的累计释放量分别为91.4%、92.8%,两种前药胶束在同一条件下释放无显著性差异,但同种胶束在两种条件下的释放量具有显著性差异,说明前药胶束具有一定的pH响应性。体外细胞试验中,选用小鼠CT-26结肠癌细胞作为研究模型,通过MTT法考察游离ART、前药胶束PBAE-ART4和PBAEART2能否抑制细胞增殖;采用流式细胞术检测前药胶束较游离ART对CT-26细胞是否具有促凋亡作用;采用JC-1作为荧光探针检测线粒体膜电位的变化,采用ELISA方法检测细胞内活性氧ROS含量;通过Western blot实验进一步考察不同青蒿琥酯制剂促进细胞凋亡相关蛋白的表达水平。实验结果得出:ART、PBAE-ART4、PBAE-ART2三种制剂的细胞半数抑制浓度(IC50)随时间呈现相同的降低趋势,IC50(2h)>IC50(48h)>IC50(72h),说明三种青蒿琥酯制剂对小鼠CT-26结肠癌细胞均具有时间依赖性的细胞毒性。此外,细胞处理相同时间,结果显示前药胶束组与游离药物ART比较,对小鼠CT-26结肠癌细胞活性作用更强。CT-26结肠癌细胞经药物处理72h后,游离药物ART、前药胶束PBAE-ART4、PBAE-ART2凋亡细胞所占比例分别达到18.41%、22.49%、26.85%,表明不同青蒿琥酯制剂对CT-26结肠癌凋亡都有作用,前药胶束促进细胞凋亡作用优于游离药物且前药PBAE-ART2作用效果优于前药PBAE-ART4。线粒体膜电位结果表明前药胶束组对线粒体膜电位的去极化能力明显优于游离药物组;与游离药物组相比,细胞内ROS水平低于前药胶束组,且PBAE-ART2作用效果优于前药胶束PBAE-ART4。三种青蒿琥酯制剂均能促进细胞色素c的表达,且凋亡相关蛋白Caspase 3及Caspase 9的表达量呈ART
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