【摘 要】
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血管抑制素(angiostatin,AS)是一种重要的血管生成抑制因子,能抑制新生血管生成和实验小鼠肿瘤生长.血管抑制素最早是从荷瘤小鼠的血流和尿中提取的,提取的含量甚微,无法大规
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血管抑制素(angiostatin,AS)是一种重要的血管生成抑制因子,能抑制新生血管生成和实验小鼠肿瘤生长.血管抑制素最早是从荷瘤小鼠的血流和尿中提取的,提取的含量甚微,无法大规模生产.基因工程是大规模生产人血管抑制素(human angiostatin,hAS)的重要途径.该课题研究在毕节酵母中诱导型和组成型表达hAS及其表达产物和纯化和生物活性分析.根据人血管抑制素基因序列合成引物,以人胚肝细胞cDNA为模板,PCR扩增出人血管抑制素基因,经DNA序列分析证明后,将其克隆于pPIC9K载体的多克隆位点,构建成表达质粒pPIC9K-AS.用电转法和原生质体法将pPIC9K-AS转化毕节酵母GS115,并用PCR技术检测转化子的hAS基因,通过G418抗性筛选高拷贝整合的转化子,构建成高拷贝hAS基因整合的毕节酵母工程菌GS115(pPIC9K-AS).选择BMGY-BMMY培养基体系诱导GS115(pPIC9K-AS)表达hAS基因.hAS表达量94mg/L.研究开始诱导时期的选择、接种量和甲醇浓度对hAS表达的影响,选择出细胞生长至A<,600>=10开始诱导、开始诱导时(Mut<+>)A<,600>=1、甲醇浓度0.75％的优化条件.在10L发酵罐中高密度发酵GS115(pPIC9K-AS),采用连续补料和甲醇诱导60h,A<,600>=217,hAS的分泌量为156mg/L.发酵物上清直接上SP-Sepharose Fast Flow柱后,再用Sephadex G100进行进一步纯化.hAS总回收率69.7％.纯度达93.5％.CAM试验结果证实hAS能抑制CAM血管生成,以100mg/kg/d的hAS皮下注射荷瘤的C57BL/6J小鼠,发现hAS抑制小鼠的B16黑色素瘤生长,抑瘤率达90.54％.
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