背景与目的:研究表明乳腺癌中有约70%为ER阳性乳腺癌,临床上ER阳性乳腺癌对阻断ERα的内分泌治疗较为敏感。然而此类癌症经长期的内分泌治疗后容易复发,因此探索有效的替代治疗方案尤为重要。此外研究表明超过30%Luminal/ER+型乳腺癌中存在PIK3CA突变,如此高的突变率表明使用PI3K激酶抑制剂或调控该途径中的关键节点可能有益于ER/PIK3CA突变乳腺癌患者。目前PI3Kα抑制剂正处于临床实验阶段并已经显示出了一定的抗肿瘤活性,然而PI3Kα抑制剂并非对所有含PIK3CA突变的患者均有较好的疗效,某些最初对于PI3Kα抑制剂敏感的患者也有可能在治疗数月后出现复发及耐药。研究表明,抑制ERα的活性可以使Luminal/ER+型乳腺癌对PI3K抑制剂尤其是对PI3Kα抑制剂更为敏感。这些研究同时也表明,在Luminal/ER+型乳腺癌中单独使用PI3K抑制剂疗效欠佳的原因是由于PI3K抑制剂促使ERα转录活性升高。因此,进一步寻找可以预测患者对PI3K抑制剂敏感性的生物标志物则显得十分重要,而对ERα表达调控的分子机制研究则可以为新的生物标志物的发现提供理论基础。BTF3即通用转录因子3已经被证明在前列腺癌等多种肿瘤中存在高表达且具有促癌的作用,然而目前并无关于BTF3在乳腺癌中的表达情况以及功能的相关研究。在本课题中我们旨在探究BTF3在Luminal/ER+型乳腺癌中的表达情况及其在乳腺癌发生发展中的生物学作用,并对其相关机制进行探索,以期发现新的治疗靶点或者为乳腺癌治疗中的联合用药提供理论依据。方法与结果:1、BTF3在多种癌症中存在高表达,通过对美国癌症基因组图谱研究计划(TCGA,The Cancer Genome Atlas)数据库数据进行分析,发现在PAM50分型中BTF3在Luminal A和Luminal B型中存在明显高表达;在病理分型中BTF3在ER阳性分组中存在明显高表达。2、由于BTF3在Luminal/ER+型乳腺癌中存在高表达,那么我们想要探究BTF3在Luminal/ER+型乳腺癌细胞中的作用。在Luminal/ER+型乳腺癌细胞细胞系MCF7和T47D中敲减BTF3利用平板克隆实验以及3D成球实验,发现敲减BTF3能够明显抑制细胞2D增长和3D成球。为了探究BTF3是否影响细胞迁移,我们利用划痕实验结果发现48小时后对照组比敲减BTF3的实验组划痕之间的面积变化大。此外平板克隆实验还发现回复BTF3的表达,能够一定程度上回复由于敲减BTF3导致的生长抑制。这些结果表明了 BTF3在Luminal/ER+型乳腺癌细胞中具有明显的促癌作用。3、确定了 BTF3可以促进细胞生长,我们接下来探究其对细胞周期的影响。流式细胞仪数据分析显示,利用siBTF3转染MCF 7细胞48h后,实验组细胞G2/M显著高于对照组。我们还研究了 BTF3对细胞存活的影响,发现敲减BTF3能诱导凋亡细胞死亡,表明BTF3在Luminal/ER+型乳腺癌细胞G2/M期转换和细胞存活中起着重要作用。4、通过分析TCGA乳腺癌数据库,Desmedt乳腺癌数据库和Wang乳腺癌数据库,发现在这些数据库内BTF3的表达在ER阳性分组中明显高于ER阴性分组,此外我们还发现在这些数据库内BTF3的表达量与ESR1的表达量存在明显线性关系。有趣的是,蛋白免疫印迹分析乳腺癌细胞中BTF3和ERα蛋白的表达情况,发现在Luminal/ER+型的乳腺癌细胞中同样存在BTF3蛋白的高表达。这些结果促使我们进一步研究BTF3与ERα之间的关系。利用siRNA敲减BTF3发现敲减BTF3能在RNA水平和蛋白水平下调ERα的表达,且敲减BTF3能够下调ERα介导转录的靶基因PGR,GREB1,IGFBP4.在MCF7细胞转染siNC或siBTF3的情况下过表达外源ERα,发现过表达外源ERα能够一定程度上回复由于敲减BTF3导致的生长抑制。这些结果表明了 BTF3一定程度上通过调控ERα促进Luminal/ER+型乳腺癌细胞的生长。5、研究表明阻断PI3K信号可诱导ERα依赖的转录激活。由于我们的实验证明BTF3在ERα转录调控中的作用,我们将进一步探究BTF3是否影响Luminal/ER+型乳腺癌细胞对PI3Kα抑制剂BYL-719的反应。利用western分析细胞内蛋白表达情况,发现BYL-719处理过的实验组细胞磷酸化AKT水平几乎完全被抑制,ERα的表达明显升高 另外我们发现单独使用siBTF3或BYL-719均能使细胞发生凋亡,联合使用siBTF3和BYL-719则能够增强细胞的凋亡,且联合使用siBTF3和BYL-719能够明显抑制细胞的3D成球能力。这些结果表明敲减BTF3可能会使Luminal/ER+型乳腺癌细胞对PI3K抑制剂BYL-719更加敏感。6、体外实验已经证明了靶向抑制BTF3能够增强Luminal/ER+型乳腺癌细胞对BYL-719的敏感性,接下来我们想在进一步探究在体内环境是否具有相似的情况。在已经构建好的ER/PIK3CA突变株MCF7乳腺癌移植模型中利用siRNA敲减BTF3并联合使用BYL-719,发现单独使用BYL-719能够导致小鼠肿瘤组织中ERα表达增高,小鼠肿瘤增长受阻,单独使用siBTF3也能够使小鼠肿瘤增长受阻并降低ERα的表达;联合使用siBTF3和BYL-719则会肿瘤体积明显变小。这些结果证明了在体内环境中敲减BTF3也能够使Luminal/ER+型乳腺癌细胞对PI3Kα抑制剂更加敏感。结论:1.BTF3在Luminal/ER+型乳腺癌中存在高表达。2.BTF3促进Luminal/ER+型乳腺癌细胞系的增殖,存活,迁移。3.BTF3调控ESR1的表达及依赖ERα的转录。4.敲减BTF3可逆转BYL-719诱导的ERα表达上调。5.敲减BTF3可使Luminal/ER+型乳腺癌细胞对BYL-719更加敏感。