[目的]当代分子生物学中微小RNA(microRNA,miRNA)介导的基因表达沉默机制已经明确。众所周知生物体内微环境中的调控网络复杂且多变,往往牵一发而动全身,这也就是各类疾病发生的根源。随着微小RNA介导的负性调控网络机制研究成熟不禁让研究者们思考是否也有可以正向调控基因的相应小分子存在。事实上,RNA激活机制(RNAa)已经不是一个陌生的话题,近十年来RNAa机制迎来了一系列的研究高潮,并且取得了类型各异的研究成果。尽管RNAa机制的研究结果目前并不统一,且物种之间也存在差异,但有一点是可以肯定的,生物体内引起基因上调的调控分子是存在的。本实验室前期在研究miR-346的相关功能时发现了一种新的小RNA介导的基因表达上调机制。该机制形式上类似于miRNAs介导的基因表达沉默,但是由于miR-346在靶定结合目标mRNA的3’UTR时暴露了特定的非结合模序“CCGCAU”,这一结合形态使得目标mRNA的翻译加强,进一步的研究发现,该模序可以与促使mRNA翻译的蛋白因子GRSF1直接相互作用并最终介导基因表达上调。这种由GRSF1介导的miRNA上调表达机制是否具有普遍性尚不清楚,因此,本课题在以上研究基础上,进行了一系列的研究来阐明这种上调机制是否具有普遍性。[方法和结果](1)将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为靶标,预测设计并构建靶定EGFP mRNA的21nt siRNA以及相应的具有非结合暴露模序CCCGCAU“的SuhRNA,运用绿色荧光蛋白自身报告基因、qRT-PCR以及western blot检测在宫颈癌细胞系HeLa中两者对EGFP蛋白表达水平的影响。实验结果显示所设计的siRNA可以下调EGFP的表达而相对应的SuhRNA可以上调EGFP的表达。接着设计构建另外两个靶定EGFP位置不同的21nt siRNA以及相对应的SuhRNAs,同样运用绿色荧光蛋白自身报告基因、qRT-PCR以及 western blot检测比较三种位置上的siRNAs和SuhRNAs对EGFP表达强度影响。试验结果显示位置间差异并不明显。(2)运用绿色荧光蛋白自身报告基因、qRT-PCR以及western blot检测敲降GRSF1后SuhRNA对EGFP表达的影响。实验结果显示相比对照组敲降GRSF1后SuhRNA介导的EGFP表达上调作用效力下降。(3)设计并构建模序"CCCGCAU"突变型SuhRNAs。分别为"CCCGCCG"突变体 1、"CCCAUGC"突变体 2、"AUCCCGC"突变体 3、"CAUAUAU"突变体4以及暴露模序"CCCGCAU"不变但两端结合部分分别向中段缩进两个碱基的突变体5。运用绿色荧光蛋白自身报告基因、qRT-PCR以及western blot检测这五种突变体对EGFP表达水平的影响。试验结果显示突变体2和突变体3相较于其他突变体对上调EGFP表达更加明显;接着将GRSF1敲降,同样运用绿色荧光蛋白自身报告基因、qRT-PCR以及western blot观察突变体们对EGFP翻译影响。结果显示除了突变体4相对于对照组没有什么变化,其余突变体对EGFP表达强度影响在敲降GRSF1后有不同程度的减少。[结论]具有依赖于GRSF1暴露模序"CCCGCAU"的SuhRNA介导的mRNA翻译加强具有普遍性,但该暴露模序对GRSF1依赖不具有特异性。