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虎斑乌贼(Sepia pharaonis)是我国重要的海洋经济头足类。由于过度捕捞、栖息地破坏和生境退化,虎斑乌贼的渔业资源自1980年代以来逐年降低,逐渐沦为濒危物种。虎斑乌贼资源的恢复和利用取决于该物种生殖特性的相关研究,然而当前我们对虎斑乌贼的生殖发育分子机制仍知之甚少。神经肽广泛分布在无脊椎动物和脊椎动物中,通常充当神经递质、神经调节剂和神经激素。神经肽FMRFamide(FLP)是已知的最大的神经肽家族,以四肽FMRFamide(Phe-Met-Arg-Phe-NH2;FMRFa)为代表。前期研究证明,FMRFamide与GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)共同参与了头足类生殖发育的调控,而此过程中FMRFamide的两种受体扮演着重要的角色。本文在此基础上,首次开展了虎斑乌贼FMRFamide两种受体基因的克隆和序列特征分析;开展了两种受体的组织表达特异性研究,并对两种FMRFamide的受体和FMRFamide前体的mRNA进行了定位;最后,我们通过体外细胞实验检测了FMRFamide对细胞蛋白分泌活动的影响。研究结果如下:1.原位杂交实验表明,虎斑乌贼视叶的中央髓质区、边缘髓质区和深层视网膜中均有FMRFamide前体基因的表达。FMRFamide前体基因的mRNA在视叶组织中的分布基本与视叶细胞中细胞核的分布一致。在食道上神经团的基叶(bl)与垂直叶(vl)的连接处和嗅叶(olf)发现有密集的FMRFamide前体基因mRNA杂交信号;免疫组化实验结果表明,虎斑乌贼视叶中的FMRFamide免疫活性区域有以下特征:在视叶的深层视网膜的网织层检测到了FMRFamide免疫活性;在边缘髓质区中检测到不规则的FMRFamide免疫反应信号纤维束向各个方向延伸;在中央髓质存在密集的免疫反应。食道上神经团中也存在着大量的FMRFamide免疫信号,这些免疫反应区域主要分布在垂直叶、亚垂直叶、嗅叶、视腺和基叶间的神经细胞和神经纤维,并且可以看到这些铁锈色的区域沿垂直叶和基叶的连接成扩散状;神经肽体外刺激细胞实验证明,SpFMRFamide单独刺激CHO-K1细胞时不会影响细胞蛋白的分泌,但与SpGnRH共同刺激细胞时却会抑制CHO-K1细胞的总蛋白分泌。2.采用同源克隆法与RACE技术获得了虎斑乌贼FMRFamide的G蛋白受体基因cDNA序列全长,命名为SpFaGPCR。虎斑乌贼FaGPCR基因的cDNA全长1518bp,包括225bp的5’非编码区(UTR)、36bp的3’UTR以及1257 bp的开放阅读框(ORF),总共编码418个氨基酸。预测SpFaGPCR相对分子量(MW)为49.8 kDa,等电点(pI)为9.76。发现该蛋白是一个具有7次跨膜(TM)区域的G蛋白偶联受体;含有7个糖基化位点和35个磷酸化位点。同源序列比对显示,SpFaGPCR氨基酸序列与曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)的FaGPCR序列(SjFaGPCR)相似度最高。系统发育树显示,虎斑乌贼FaGPCR与双壳纲物种的FaGPCR聚为一类,与节肢动物关系较远;组织差异性实验结果显示,相对于其它组织FaGPCR在虎斑乌贼的视叶、脑、缠卵腺中表达量较高;原位杂交实验结果显示,在视叶的髓质区、视网膜的感光细胞、缠卵腺的瓣叶外层均能观察到明显的SpFaGPCR mRNA阳性信号。另外,根据SpFMRFamide前体mRNA在视叶中的表达,我们推测深层视网膜细胞可能通过旁分泌机制影响了髓质区域细胞的生理活性,而髓质中的神经细胞可能通过自分泌机制对分泌FMRFamide的微环境进行调节。3.采用同源克隆法与RACE技术获得了虎斑乌贼FMRFamide的钠离子通道受体基因cDNA序列,命名为SpFaNaC。SpFaNaC基因的cDNA全长2090p,其中包括265bp的5’-UTR、46bp的3’-UTR以及1799 bp的ORF,编码593个氨基酸。预测其MW为63.9KDa,pI为12.5。预测SpFaNaC含有6个糖基化位点和70个磷酸化位点。对SpFaNaC的三级结构进行预测发现其包含45%的α螺旋结构、12%的扩展链和43%的无规则卷曲。系统发育树结果显示,虎斑乌贼FaNaC与腹足纲物种的FaNaC聚为一类,与双壳纲相对较远;组织差异性实验显示,相对于其它组织SpFaNaC在虎斑乌贼的视叶、脑中有较高的表达;原位杂交实验结果显示,在视叶的深层视网膜、视网膜的感光细胞体、食道上神经团内均能观察到阳性信号。