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研究背景:TP53是DNA序列依赖性核转录因子,在细胞受到刺激时,调控一系列的细胞进程,比如细胞周期阻滞、细胞凋亡及细胞代谢等,从而促使DNA修复,减少癌症因子的积累。TP53突变在肿瘤之中非常常见,其突变位点主要集中在DNA结合域,对于其功能及机制研究已有多篇文献报道。目前,我们在临床上观察到一例肿瘤病人,p53编码基因发生突变,其位点位于C末端的374位点,并且因为读码框错误,而出现氨基酸编码改变,导致C末端延长48个氨基酸(p53-374*48)。经过数据库查询,发现C末端延长的p53突变不在少数,也有发生在终止密码子的突变,并延长78个氨基酸(p53-393*78)。此类C末端延长的p53突变在多种肿瘤当中出现,如结直肠癌、肺癌、乳腺癌及前列腺癌等。然而,目前对于此类C末端延长的突变p53在肿瘤当中发挥的作用及其机制,还未有相关的报道。因此,对于这类C末端延长的突变p53在肿瘤发生发展当中的作用及其机制值得我们进一步关注及探讨,为临床治疗提供坚实的理论基础。目的:探索C末端延长突变p53(p53 mutants with long C-terminus,p53LCs)的功能改变及其作用机制。方法:(1)在p53 null细胞当中表达p53LCs,细胞增殖及克隆形成实验观察p53LCs的功能改变;Western blot和q PCR检测p53LCs对下游靶基因的蛋白及m RNA表达的影响;(2)在表达或者不表达p53LCs的情况下,细胞克隆形成实验研究p53LCs对野生型p53功能的影响;在表达或者不表达p53LCs的情况下,使用不同激动剂刺激野生型p53的表达及功能,采用Western blot及q PCR探究p53LCs是否影响野生型p53激活下游靶基因的表达,从而发挥负性抑制作用(Dominant negative effect,DNE);(3)采用核质分离及免疫荧光技术探究p53LCs在细胞的分布情况,及其是否会影响野生型p53在细胞核的分布;(4)采用染色质免疫沉淀技术探究p53LCs转录调控下游靶基因的功能,及其是否会阻碍野生型p53的转录功能;采用Western blot检测p53LCs的乙酰化情况;(5)测定p53LCs的半衰期以及p53LCs是否会通过MDM2介导的泛素化而降解;(6)构建稳定表达p53LCs的H460细胞,通过细胞增殖实验探索p53LCs是否通过负性抑制作用,抑制野生型p53的功能,从而对抗肿瘤药物产生拮抗作用。结果:(1)细胞增殖及克隆形成实验显示,与表达野生型p53组相比,表达p53LCs组不能抑制细胞的生长和增殖;同时免疫印迹及q PCR实验结果显示,表达p53LCs组与表达野生型p53组比较,激活下游靶基因表达的能力明显下降,表明p53LCs丧失了原有的野生型p53的功能。(2)细胞克隆试验结果显示,野生型p53可以明显抑制细胞的增殖,而p53LCs组不能抑制细胞的增殖,并且在野生型p53与p53LCs共表达时,p53LCs可以明显消除野生型p53抑制细胞生长和增殖的功能;同时免疫印迹实验及q PCR实验结果显示,在使用激动剂激活野生型p53后,p53LCs的表达可以抑制野生型p53的激活,抑制下游靶基因的转录表达,从而证明p53LCs具有DNE作用。(3)核质分离和免疫荧光结果显示p53LCs主要分布在细胞质当中,而野生型p53主要分布在细胞核当中,当p53LCs和野生型p53共表达时,p53LCs可以结合野生型p53,使野生型p53滞留在细胞质中,不能进入细胞核发挥转录因子的作用。(4)染色质免疫沉淀结果显示p53LCs结合下游靶基因启动子区的能力明显下降,可能与C末端突变造成乙酰化能力下降有关;同时p53LCs可以抑制野生型p53与下游靶基因启动子区结合,更进一步证明p53LCs具有DNE作用。(5)免疫印迹结果显示p53LCs的半衰期明显延长,不能被MDM2诱导降解,尽管其仍然可以被MDM2介导泛素化。(6)细胞增殖及克隆实验结果显示,使用放线菌素(Actinomycin D,Act D)处理后,稳定表达p53LCs的H460肿瘤细胞相较对照组,细胞生长及克隆形成能力具有明显优势,拮抗放线菌素的作用。结论:本研究实验结果首次证实突变p53LCs丢失了原有的野生型p53的功能,同时发挥DNE作用,抑制野生型p53的激活,拮抗Act D治疗肿瘤的效果。其机制可能是p53LCs主要分布在细胞质,并且可以结合野生型p53,使其滞留在细胞质中,不能发挥转录因子的作用。