霍山石斛(Dendrobium huoshanense Tang et Cheng)是多年生兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)植物,在中国传统中药里被誉为仙草之首,同时也具有观赏价值。本研究对霍山石斛原球茎和试管苗的离体培养条件进行优化;对不同光周期培养条件下原球茎和试管苗的增殖率、器官发生和组织细胞形态结构以及多糖含量进行了观察和测定;以原球茎和试管苗为材料,克隆了生物钟中央振荡器核心基因(CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1,CCA1)和与中央振荡器相关的抗逆基因MYB1R1,对CC41基因和MYB1R1基因进行不同光周期处理,并研究分析其定量表达结果,最终通过综合研究离体培养条件下不同光周期、不同培养环境、增殖率、多糖含量及基因表达的关系,为揭示霍山石斛多糖代谢机理提供实验生物学和分子生物学的理论和依据。1不同光周期条件下霍山石斛的增殖率霍山石斛原球茎培养于MS+NAA O.1mg/L+KT 0.05mg/L+土豆汁 50 g/L 培养基,试管苗培养于 1/2MS+IBA 0.5mg/L+NAA0.5 mg/L+香蕉汁200g/L培养基,比较了原球茎及试管苗在不同光周期处理下的增殖率。试验结果表明,不同光周期对原球茎增殖率有一定影响:在黑暗培养条件下最低;在24h、18h、12h、6h光照的光周期条件下培养50天时增殖率达到最高并具有相近的增殖率;其中以18小时光照在培养50天时增殖率达到最高;同时24小时光照条件下增殖率在各培养时间段都表现出最高值并在培养40d时已经接近峰值。不同光周期对试管苗增殖率影响幅度较原球茎的小;自培养10d后,以12h/12hL/D光照条件下增殖率领先,并保持最高。但总体上原球茎增殖率远高于试管苗增殖率。2不同光周期培养条件下多糖含量的测定霍山石斛原球茎培养于MS+NAA0.1mg/L+KT 0.05mg/L+土豆汁 50 g/L 培养基,试管苗培养于 1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基,比较原球茎及试管苗在不同光周期下的多糖含量。试验结果表明:6小时光照和全黑暗条件下多糖积累首先到达最高值,之后逐渐降低;其中以原球茎在6小时光照条件下培养10d多糖含量已达到峰值。24小时光照处理条件下的原球茎和试管苗多糖含量在培养30d时同样达到高水平,之后逐渐降低;其中以试管苗在24小时光照处理下培养至30d达到峰值。培养40d及之后,各光周期条件均表现出多糖含量下降至接种时的多糖含量,说明在培养基养分接近消耗殆尽时(40d-50d),无法继续进行多糖积累,只能维持自身生长发育。不同光周期对试管苗的多糖含量较对原球茎的影响较大,在培养1Od之后,光照的增加与多糖含量呈正相关。试管苗多糖积累水平均高于同期培养时间的原球茎,而原球茎的多糖积累早于试管苗的多糖积累。3 CCA1基因和MYB1R1基因的克隆和生物信息学分析以霍山石斛原球茎和试管苗为材料,结合同源克隆和RACE技术,首次获得了霍山石斛CC41基因和MYB1R1基因的cDNA全长:(CC41基因cDNA全长为1652 bp,登录号为KX710175;MYB1R1基因cDNA全长1332bp,登录号为KX710176。这2条基因的cDNA序列的开放阅读框分别编码532和427个氨基酸。通过对CCA1基因和MYB1R1基因进行生物信息学分析发现CCA1是碱性蛋白,MYB1R1是酸性蛋白,都不具有信号肽,也都不属于分泌蛋白;其中CCA1和MYB1R1中均含有myb保守结构域,证明了 CCA1与MYB1R1同属于MYB转录因子家族。4 CC41基因和MYB1R1基因定量表达分析以Actin基因为内参基因,对CC41基因和MYB1R1基因在原球茎和试管苗不同光周期处理下的表达水平进行定量表达分析。本实验以接近自然昼夜周期的12小时光照为参照组,在培养第1d、10d、20d、30d、40d及50d时对材料进行基因定量表达分析。结果显示:CCA1基因、MYB1R1基因在原球茎中的表达趋势基本相同,在试管苗中的表达趋势也基本相同。CC41基因在原球茎中一般先于MYB1R1基因出现表达波动,在试管苗中两者则基本同步。CC41基因、MYB1R1基因在原球茎的表达趋势和试管苗中的表达趋势都不相同。两者在原球茎中的表达量高于试管苗中的表达量。根据长时间尺度基因表达的数据推测:MYB1R1基因具有部分生物钟的节律功能,或是与生物钟中央振荡器直接作用的基因。原球茎在培养第30d时,每隔6h对不同光周期处理材料取样,以12小时光照为参照组,观察CC41基因和MYB1R1基因在24h内的变化趋势。结果显示:CC41基因在30d时已经全部偏离12h/12h光周期,出现不等振幅及不同光周期的现象;MYB1R1基因在培养第30d时与CCA1基因相比更接近原来的12h/12h光周期;MYB1R1基因在本实验条件下也出现不等振幅及周期变化;MYB1R1基因与CC41基因表达趋势相近。根据短时间尺度基因表达的数据推测:MYB1R1基因可能具有部分生物钟的节律功能,或是与生物钟中央振荡器直接作用的基因。以18SrRNA为参照,在半浸没及干旱胁迫等条件下处理48小时,结果显示MYB1R1基因在半浸没及干旱处理条件下出现明显表达变化,在黑暗条件下也出现高表达,说明MYB1R1基因与光照和干旱胁迫有关,可能参与干旱的信号传导。综上所述,以CC41基因为参照标志的光周期研究发现,光周期影响霍山石斛的多糖含量,以及增殖率和干物质含量;原球茎更适于光周期诱导的多糖含量调控。CC41基因在原球茎中的上升表达早于在试管苗中的表达。CC41基因在出现高上调表达后,一般会导致各生理指标的提高。CC41基因、MYB1R1基因在原球茎中表达的幅度大于在试管苗中的幅度,但CCA1基因和MYB1R1基因表达趋势基本相似。在第30d的24h时间尺度上研究中发现,CCA41基因和MYB1R1基因在偏离半光照条件下出现时间偏离和表达不均衡。MYB1R1基因具有部分生物钟的节律功能,并可能参与干旱信号传导。本文在兰科植物里第一次提供了M B1R1基因参与光周期和干旱胁迫的表达研究数据。5同步提取RNA和多糖的技术以霍山石斛愈伤组织、愈伤组织和原球茎为材料,提取材料中RNA后,收集提取过程中的废弃物进行多糖提取。结果显示RNA提取质量符合基因表达研究的需要,而且提取的多糖可以与标准的多糖提取具有稳定的对应关系,使原位并实时研究基因表达和多糖分析成为可能。综上所述,本研究改进了霍山石斛的离体培养条件,揭示了培养条件下霍山石斛培养物多糖含量的变化规律,克隆了生物钟相关基因并进行生物信息学分析,在长时间尺度和短时间尺度水平上对基因表达进行了研究,对霍山石斛在离体培养条件下以增殖和干物质比重为背景进行了多糖积累机制的讨论。同时,本研究还创新了多糖和核酸的同步提取技术,为进一步高效开展霍山石斛的分子生物学研究提供了较理想的方法。最终通过综合研究离体培养条件下不同光周期、不同培养环境、增殖率、多糖含量及基因表达的关系,为揭示霍山石斛多糖代谢机理提供了实验生物学和分子生物学的理论和依据,为提高霍山石斛研究效率提供了优化的技术方法。